軟組織損傷動(dòng)物模型及其評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

江煒,梁嘉欣,陳艷芬

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

軟組織損傷(soft tissue injury)是臨床一種多發(fā)病,是指因急性外傷或慢性勞損或其他原因?qū)е碌钠つw、肌肉肌腱、關(guān)節(jié)囊及神經(jīng)等組織的病理?yè)p傷,但不包括骨骼疾病如骨折、脫位等,臨床主要表現(xiàn)為局部軟組織的青紫、瘀斑、腫脹、疼痛、功能障礙等[1]。損傷后機(jī)體局部主要以炎性反應(yīng)為主,組織損傷后即進(jìn)入修復(fù)階段,修復(fù)過程是炎癥因子、生長(zhǎng)因子協(xié)調(diào)細(xì)胞過程的復(fù)雜信號(hào)的整合。雖然軟組織損傷在臨床上治療方法較多,但由于缺乏有效的評(píng)價(jià)方法,研究水平目前仍偏低。為了系統(tǒng)地總結(jié)軟組織損傷的相關(guān)研究,為臨床治療和基礎(chǔ)研究提供借鑒,本文對(duì)急、慢性軟組織損傷動(dòng)物模型及其評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 急性軟組織損傷模型

1.1 重物擊打致軟組織損傷模型

重物擊打致軟組織損傷模型是通過重物在一定高度自由落下打擊軟組織部位導(dǎo)致的損傷,是目前軟組織損傷模型中最為常用的,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可選擇小鼠、大鼠或兔子。劉俊寧等[2]等選用小鼠,將其固定后用50 g砝碼作為打擊錘,打擊高度5 cm,自由落體打擊標(biāo)記處,連續(xù)5次,造成小鼠局部急性軟組織損傷。有學(xué)者[3-4]取雄性SD大鼠,用200 g圓臺(tái)型錘,從光滑硬塑管長(zhǎng)75 cm內(nèi)徑1.5 cm,自由落下打擊小腿肌肉,無骨折現(xiàn)象,造成急性軟組織損傷。申旭霽等[5]取日本大耳白兔,使500 g重的砝碼通過比砝碼直徑略大的塑料管腔自30 cm 高處垂直自由落體擊打同一部位連續(xù)5次,造成兔軟組織挫傷,并證實(shí)無骨折現(xiàn)象。重物擊打致急性軟組織損傷造模方法簡(jiǎn)單,成模率高,且與臨床中的常見軟組織損傷較接近；但是在打擊高度、打擊次數(shù)及打擊重量,都未解決“定量”的關(guān)鍵性問題,缺乏對(duì)損傷程度標(biāo)準(zhǔn)化和量化的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),有可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致[6]。

1.2 機(jī)械沖擊急性軟組織損傷模型

機(jī)械沖擊急性軟組織損傷模型,通過在軟組織部位給予一定的沖擊力,對(duì)其造成損傷。Robert等[7]選用雄性Wistar大鼠,麻醉后,然后采用計(jì)算機(jī)輔助的高壓沖擊裝置,氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)加速11 mm螺栓,沖擊速度7 m/s的條件下,螺栓接觸大腿軟組織,向下沖擊深度為11 mm,停留時(shí)間為0.1 s,造成封閉性軟組織損傷。余飛等[8],取SD大鼠,右后肢褪毛,伸膝、趾背屈約90°位固定,并用紗布?jí)|將右后肢稍墊起(防止骨折),將直徑為1.1 cm的鐵質(zhì)螺母固定器置于小腿腓腸肌中段上方壓緊,500 g砝碼從30 cm高處自由下落,動(dòng)能1.47 J,作用在固定器上方,同一部位連續(xù)打擊10次,造成急性軟組織損傷。

1.3 銳性切割急性軟組織損傷模型

銳性切割急性軟組織損傷模型是通過將皮膚及肌肉切割,造成的開放型損傷。Sefei等[9]將雄性Wistar大鼠麻醉后,左側(cè)股骨頸處切開,解剖皮膚層、皮下層、肌肉層。微型鑷子處理30 s,縫合,24 h后成模。趙道洲等[10]取日本大耳白兔麻醉后,剪開皮膚,鈍性剝離以暴露腓腸肌,在距肌腱止點(diǎn)6.5 cm 處用手術(shù)刀做不完全銳性切割,做一長(zhǎng)0.8 cm,寬0.4 cm 的切口,壓迫止血,24 h后成模,會(huì)出現(xiàn)切割局部紅腫、瘀血及跛行等現(xiàn)象。由于傷口直接暴露于空氣中易發(fā)生感染,Shang等[11]通過注射抗生素防治感染,但也有學(xué)者為了研究感染性軟組織損傷,向切割部位滴加金黃色葡萄球菌菌液導(dǎo)致軟組織損傷感染[12]。

1.4 肌肉拉伸急性軟組織損傷模型

張勝年等[13]將麻醉的大鼠仰臥位左右足固定于固定板上,踝關(guān)節(jié)游離狀態(tài),然后在大鼠大腿近、遠(yuǎn)端分別插入一根銀質(zhì)針電極,連接電刺激儀,以50 V的電壓刺激小腿三頭肌肌群使其強(qiáng)直收縮,同時(shí)以 0.55 m/s 的速率反向牽拉大鼠足底固定板,迫使大鼠小腿三頭肌發(fā)生離心收縮,從而造成大鼠骨骼肌急性牽拉傷。郭小琳等[14]將麻醉的大鼠俯臥固定于大鼠固定板上,固定大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)和小腿,用生理實(shí)驗(yàn)儀 YSD-4GA(頻率為128 Hz,強(qiáng)度為 50 V),電刺激大鼠右側(cè)腓腸肌兩端,使其強(qiáng)制性收縮,踝關(guān)節(jié)發(fā)生跖屈趨勢(shì)。與此同時(shí),砝碼從固定高度自由下落(200 g, 100 cm),通過系在大鼠腳上的繩子以一個(gè)恒定的基本沖量,使踝關(guān)節(jié)迅速背屈。腓腸肌強(qiáng)直性收縮拉傷,造成該肌肉急性拉傷,既而形成軟組織損傷動(dòng)物模型。

1.5 其他急性軟組織損傷模型

除上述軟組織損傷造模方法還有一些較少運(yùn)用的方法,如注射法 、壓迫法、爆炸性軟組織傷模型及軟組織血管放射損傷模型等。注射法是通過取自身的血液注入軟組織部位引起的炎癥[15]、腫脹及瘀血等癥狀,造成軟組織損傷。壓迫法是通過長(zhǎng)時(shí)間或者多次給予壓迫,使動(dòng)物局部組織損傷,如張楠等[16],通過在長(zhǎng)時(shí)間在大鼠兩側(cè)后肢的股薄肌處上下側(cè)各放置一塊相同規(guī)格的永久性磁鐵進(jìn)行施壓,造成軟組織損傷。爆炸性軟組織傷模型,如王翔等[17-18]將點(diǎn)爆源置于垂直于動(dòng)物面部咬肌前緣中點(diǎn)上方處引爆,造成面部軟組織損傷。臨床上放射治療腫瘤的同時(shí)也會(huì)引起組織血管的損傷,王代友等[19]將雄性 Wistar 大鼠選取右后肢作為照射部位, 以60Coγ射線為放射源, 采用遠(yuǎn)距離外照射的方式,每次每只大鼠的吸收劑量為2 Gy,90 s內(nèi)完成,每周照射3 次,共5周形成軟組織血管放射損傷模型。

2 慢性軟組織損傷動(dòng)物模型

2.1 重物擊打致慢性軟組織損傷模型

重物擊打致慢性軟組織損傷模型,打擊方法同急性軟組織損傷相同,但打擊后長(zhǎng)時(shí)間不給予治療,造成的慢性軟組織損傷。高漸聯(lián)等[20]將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈 90°位,將200 g 重的砝碼垂直高處(50 cm)自由落體打擊大鼠外側(cè)肌肉豐厚處,連續(xù)擊打3 次,打擊面積約 1 cm2,不做處理正常飼養(yǎng) 2 周。楊威等[21]取新西蘭兔,采用質(zhì)量約0.8 kg、邊緣鈍的金屬物體,在30 cm高度自由落體,擊打兔右大腿部,重復(fù)3次,正常飼養(yǎng)6 d,造成慢性軟組織損傷動(dòng)物模型。

2.2 機(jī)械沖擊慢性軟組織損傷模型

機(jī)械沖擊慢性軟組織損傷動(dòng)物模型,通過控制每次打擊動(dòng)能,給予相同的機(jī)械沖擊,模型重復(fù)率高穩(wěn)定性好,撞擊后長(zhǎng)時(shí)間不給予處理,造成慢性軟組織損傷。董靜等[22]將大鼠后肢固定,用質(zhì)量為335 g打擊物從80 cm高空垂直下落,動(dòng)能為2.63 J,打擊面積為1 cm2,受傷局部區(qū)域皮膚完整,已經(jīng)解剖及組織學(xué)驗(yàn)證成功率為100%。之后不作處理正常飼養(yǎng)15 d,形成慢性軟組織損傷動(dòng)物模型。

2.3 銳性切割慢性軟組織損傷模型

通過切割軟組織與長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)合,導(dǎo)致動(dòng)物軟組織長(zhǎng)期損傷且持續(xù)運(yùn)動(dòng)加重?fù)p傷,從而形成慢性軟組織損傷。Shang等[11]將大鼠麻醉后從髕骨內(nèi)側(cè)切口,切開內(nèi)側(cè)副韌帶,開放膝關(guān)節(jié)腔,用眼刀前后切開交叉韌帶,術(shù)中關(guān)節(jié)軟骨表面無損傷,止血后逐層縫合；第7天每組用動(dòng)物跑步機(jī)訓(xùn)練模擬運(yùn)動(dòng)損傷,連續(xù)訓(xùn)練20 d,然后大鼠正常飼養(yǎng)2周,形成慢性軟組織損傷。該模型損傷外觀明顯,易于觀察整個(gè)損傷及恢復(fù)過程,易于藥物的藥效評(píng)價(jià)。

2.4 下坡跑慢性軟組織損傷模型

通過訓(xùn)練大鼠長(zhǎng)期下坡跑,導(dǎo)致肌腱損傷,該動(dòng)物模型與生活中長(zhǎng)期走下坡路導(dǎo)致肌腱損傷相近,但造模時(shí)間長(zhǎng)、成模率低,導(dǎo)致運(yùn)用較少。秦樂等[23]將下坡跑與打擊法結(jié)合,改良了下坡跑慢性軟組織損傷模型,先通過篩選出配合下坡跑訓(xùn)練的大鼠,后重物打擊大鼠大腿右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌,造成局部鈍挫傷。每周下坡訓(xùn)練2次,共8周,然后正常飼養(yǎng)4周,12周后形成慢性軟組織損傷模型。

2.5 肌肉拉伸慢性軟組織損傷模型

在電刺激輔助,使動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間做跑跳運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致肌肉拉傷。牛文玉等[24]采用高壓低流電刺激儀刺激動(dòng)物,使其產(chǎn)生跑跳運(yùn)動(dòng),具體方案如下：每只動(dòng)物每隔12 s刺激1次,每次刺激時(shí)間持續(xù) 0.1～0.2 s,每天訓(xùn)練60 min,分 3 次進(jìn)行,兩次訓(xùn)練間隔20 min。每天跑跳約300 次,每周連續(xù)訓(xùn)練5 d,連續(xù)訓(xùn)練5周,造成慢性軟組織損傷。

3 軟組織損傷指標(biāo)觀察

3.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo)

形態(tài)學(xué)是軟組織損傷最基本的觀察指標(biāo),也是最直接反應(yīng)軟組織損傷恢復(fù)的情況的指標(biāo)。軟組織損傷會(huì)出現(xiàn)紅腫、瘀青、跛行等癥狀,可采用肉眼觀察、HE染色、超聲檢查等方法來觀察其形態(tài)變化。其中肉眼觀察指標(biāo)評(píng)分是目前文獻(xiàn)使用較多的標(biāo)準(zhǔn)(見表1[25-26])。章建華等[27]在三黃軟膏治療急性軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究中,通過觀察大鼠軟組織損傷部位紅腫、跛行及疼痛感,治療組大鼠外觀形態(tài)恢復(fù)較模型組快。也有學(xué)者[28]通過對(duì)軟組織損傷部位做HE染色、超聲圖譜,觀察到損傷恢復(fù)情況包括組織結(jié)構(gòu)、炎癥浸潤(rùn)、血管等。

表1 損傷指數(shù)評(píng)分表Table 1 Injury index score table

3.2 血液學(xué)指標(biāo)

血液學(xué)指標(biāo)主要包括血液流變學(xué)、血小板活性、血清膽紅素、血清微量元素等指標(biāo)檢測(cè),主要研究局部微循環(huán)血流速度、血流量變化和血液黏稠度等。魏優(yōu)秀等[29]在治傷軟膏外敷治療大鼠急性軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究中,證實(shí)治療組的血液流變學(xué)檢測(cè)全血黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞還原黏度與對(duì)照組比較明顯降低；說明治傷軟膏外用治療急性軟組織損傷模型大鼠,能明顯降低血液黏度、改善其血液流變性、促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。王佳等[30]在鄭氏筋導(dǎo)散對(duì)大鼠急性軟組織損傷的影響及血液流變學(xué)機(jī)制分析中,得到鄭氏筋導(dǎo)散與七厘散都能改善大鼠急性軟組織損傷后血液的黏滯狀態(tài),改善全身血液循環(huán),具有較好的活血化瘀功能。軟組織損傷后血液黏度增大,血流速度降低[31],藥物治療軟組織損傷過程中有無改變血液狀態(tài),是觀察藥物對(duì)軟組織損傷是否有效的一個(gè)重要指標(biāo)。

3.3 炎癥因子

軟組織損傷及恢復(fù)整個(gè)過程有較多炎癥因子參與,其中起主要作用的是腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì),能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體,并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化,參與機(jī)體的免疫應(yīng)答,是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑。IL-8能刺激中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的趨化,促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒,釋放彈性蛋白酶,損傷內(nèi)皮細(xì)胞,使微循環(huán)血流淤滯,組織壞死,造成器官功能損傷。Truflandier等[32]在機(jī)械通氣調(diào)節(jié)大鼠脊髓損傷后炎癥因子的表達(dá)研究中,發(fā)現(xiàn)軟組織損傷誘導(dǎo)局部IL-6表達(dá),機(jī)械通氣對(duì)炎癥因子產(chǎn)生影響,使大鼠脊髓中TNF-α獨(dú)立升高,IL-1β水平降低。楊威等[33-35]在701跌打鎮(zhèn)痛膏對(duì)新西蘭兔急、慢性軟組織損傷的作用及機(jī)制研究中,結(jié)果表明降低組織中IL-1、IL-6等炎癥因子含量利于軟組織損傷恢復(fù)。

3.4 生長(zhǎng)因子

生長(zhǎng)因子能促進(jìn)細(xì)胞分化分裂,加快組織愈合,在軟組織損傷恢復(fù)過程中起到不可代替的作用,特別是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)家族、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等[36]。楊?yuàn)檴櫟萚37]在研究ZD制劑對(duì)軟組織損傷的藥效時(shí),得到ZD制劑在馬急性軟組織損傷模型中能夠調(diào)控VEGF、bFGF的表達(dá),促進(jìn)成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管,肌細(xì)胞再生來進(jìn)行組織修復(fù)。Scott等[38-39]收集了22例接受髕腱開放性縫合的患者和10例接受脛骨髓內(nèi)釘治療的患者的髕腱組織,發(fā)現(xiàn)VEGF在髕腱中表達(dá)的患者比未檢測(cè)到VEGF的患者癥狀持續(xù)時(shí)間短,VEGF表達(dá)增加有利于軟組織損傷的恢復(fù)。

3.5 其他指標(biāo)

目前在軟組織損傷研究中,除以上指標(biāo)外還有一些常用指標(biāo),如一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化氫酶(CAT)等,大部分與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。覃博等[40-42]在接活跌打膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠的影響及機(jī)制研究中,接活跌打膏對(duì)軟組織損傷模型大鼠損傷組織 SOD、MDA水平的影響和正常對(duì)照組比較,模型組大鼠損傷組織SOD的活性顯著下降,損傷部位MDA水平顯著增高。與模型組比較,接活跌打膏28 g/kg藥材劑量組可顯著提高損傷組織SOD 的活性,降低損傷部位MDA水平。SOD和MDA參與軟組織損傷恢復(fù)過程,在軟組織損傷的病理狀態(tài)下,自由基生成增多,且自由基清除酶活性降低,動(dòng)態(tài)平衡被破壞,啟動(dòng)自由基連鎖反應(yīng),引發(fā)膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),造成組織損傷的進(jìn)一步惡化。MDA是氧自由基攻擊脂質(zhì)導(dǎo)致過氧化的代謝終產(chǎn)物,反應(yīng)體內(nèi)自由基的生成水平及對(duì)組織的損傷程度,SOD可以催化氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng),降低自由基含量。

4 小結(jié)與展望

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的一種主要手段[43],所以選擇合適的動(dòng)物模型與評(píng)價(jià)指標(biāo)尤為重要,最好與實(shí)際臨床癥狀及病理學(xué)改變相關(guān)指標(biāo)相似、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單。綜上所述,軟組織損傷目前最常用的是重物擊打致?lián)p模型,與臨床中軟組織被重物打擊后,導(dǎo)致的損傷相近,其造模成功率高、方法簡(jiǎn)單、造模時(shí)間短等,但打擊的高度、打擊物的重量、打擊次數(shù)存在較大差異,導(dǎo)致模型維持時(shí)間癥狀不穩(wěn)定；肌肉拉伸軟組織損傷模型,與臨床中運(yùn)動(dòng)性肌肉拉傷相近,造模成功率高、時(shí)間短,但造模方法相對(duì)其他較復(fù)雜,需要電刺激大腿肌肉,使其強(qiáng)制性收縮,同時(shí)用一定力拉伸腿部,導(dǎo)致肌肉拉傷；銳性切割軟組織損傷模型,與臨床中軟組織被銳器切割導(dǎo)致的損傷相近,造模成功率高,重復(fù)性高。大多慢性軟組織損傷模型建模時(shí)間長(zhǎng)、成模率低,導(dǎo)致研究慢性軟組織損傷研究的學(xué)者較少,但隨著社會(huì)的發(fā)展人們對(duì)慢性疾病越來越關(guān)注,學(xué)者應(yīng)該重視慢性軟組織損傷的研究。此外,目前軟組織損傷研究,較少?gòu)姆肿蛹盎蛩窖芯繐p傷的機(jī)制,藥物如何影響炎癥因子和生長(zhǎng)因子的信息傳遞,而參與調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)、局部組織的修復(fù)等過程,這些有可能成為軟組織損傷研究的重點(diǎn)。