用HPLC-MS法測定異葉天南星中L-瓜氨酸的含量

吳麗群

(福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)訓(xùn)實(shí)驗(yàn)中心，福州 350002)

天南星為天南星科天南星屬植物天南星Arisaemaerubescens(wal1.)Schott、異葉天南星ArisaemaheterophyllumBl.或東北天南星ArisaemaamurenseMaxim.的干燥塊莖，其性溫，氣微辛，味苦，具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙等功效，臨床用于治療頑痰咳嗽、胸膈脹悶、中風(fēng)、口眼歪斜等疾病。目前發(fā)現(xiàn)天南星含有多種化學(xué)成分，如黃酮類、多糖類、氨基酸類等[1,2]。其中L-瓜氨酸是主要的生理活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)血液循環(huán)、抗衰老、提高男性性功能等重要作用[3]。其分析方法主要有液相色譜法[4，5]、酶法[6]、分光光度法[7]和氣質(zhì)聯(lián)用法[8]。分光光度法測定L-瓜氨酸需要脫色，顯色過程不易控制。以2，4-二硝基氟苯為衍生劑的液相色譜法測定L-瓜氨酸，雖然方法靈敏、 重復(fù)性好，但衍生物見光易分解。目前關(guān)于L-瓜氨酸的HPLC-MS檢測方法國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究建立的HPLC-MS法測定異葉天南星中L-瓜氨酸的含量，操作簡便，適用范圍廣，結(jié)果具有良好的線性、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 6410液相色譜與串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；KQ2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。225D十萬分之一電子天平(德國賽托利斯公司)

1.2 藥品和試劑 異葉天南星 (批號(hào)130401、130702、140304， 四川輔正藥業(yè)有限公司， 經(jīng)福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系楊暉副教授鑒定為正品)；L-瓜氨酸對(duì)照品 (含量≥98%， 中國藥品生物制品檢定研究院， 批號(hào) 0875-200205)；乙腈(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào) T2009030)；甲酸(分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司，批號(hào) 080108)；鹽酸(分析純，泉州東海試劑有限公司，批號(hào) 0909115)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱: Ultimate AQ-C18柱(100 mm×4.6 mm，3 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87)；流速：0.3 ml/min；柱溫：30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，源噴射電壓：2500 V；離子源溫度：350 ℃；采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。用于定量分析的離子L-瓜氨酸m/z176→70，裂解電壓：75 V，碰撞能量：30 eV。

2.3 溶液的配制 (1)對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取L-瓜氨酸對(duì)照品19.60 mg，用150 ml去離子水溶解并定容至200 ml，搖勻，配制成濃度為98 μg/ml的L-瓜氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)供試品溶液：取異葉天南星適量，粉碎，過60目篩。精密稱定細(xì)粉3 g，置具塞錐形瓶中，加入10倍量的0.1 mol/L鹽酸溶液，超聲提取3次，每次30 min，合并上清液，70 ℃水浴濃縮，過濾，定容至50 ml，作為樣品溶液。

2.4 專屬性考察 對(duì)照品溶液(A圖)及供試品溶液(B圖)的HPLC-MS譜圖見圖1。結(jié)果表明，溶劑在與對(duì)照品相同保留時(shí)間的位置上，無相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，說明其他組分不干擾L-瓜氨酸成分的測定。

圖1 異葉天南星的HPLC-MS譜圖

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取L-瓜氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，配制成濃度為0.019 1、0.076 5、0.306 3、1.225 5、2.451 1、4.902 2、9.804 3 μg/ml的對(duì)照品溶液，分別注入HPLC-MS儀，按2.1及2.2項(xiàng)下條件測定峰面積，記錄色譜圖；以對(duì)照品峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(c)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：A=5 039.3c-371.99，r=0.999 3(n=7)，L-瓜氨酸在0.019 1～9.804 3 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為9.804 3 μg/ml的對(duì)照品溶液，按照2.1及2.2項(xiàng)下條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得對(duì)照品中L-瓜氨酸平均峰面積的RSD為2.27%(n=6)，表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取異葉天南星樣品(批號(hào)130401)，按2.3項(xiàng)下(2)方法平行制備6份供試品溶液，按2.1及2.2項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，結(jié)果L-瓜氨酸平均含量的RSD為2.64%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取異葉天南星供試品溶液5 μl，在同一條件下分別于0、1、2、6、8、12 h 進(jìn)樣，測得平均峰面積的RSD為0.94%(n=6)，表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足含量測定要求。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的異葉天南星樣品(批號(hào)130401)約0.5 g，共6份，加入一定量的L-瓜氨酸對(duì)照品，按照2.3項(xiàng)下(2)方法制備溶液，以2.1及2.2項(xiàng)下條件進(jìn)樣5 μl進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.10 樣品含量測定 取3批異葉天南星樣品，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.5項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為130401、130702、140304的異葉天南星中L-瓜氨酸含量分別為(103.42±1.73)、(103.27±1.84)和(101.34±2.01) μg/g生藥。

3 討 論

氨基酸的極性很強(qiáng)，在普通C18色譜柱上沒有色譜保留，因此本研究采用Ultimate AQ-C18色譜柱進(jìn)行L-瓜氨酸的分析測定。質(zhì)譜測定無需衍生化，可以通過正離子多反應(yīng)監(jiān)測定量離子對(duì)準(zhǔn)確檢測，并且為了提高氨基酸的色譜保留，采用了親水極性色譜柱，與HPLC法比較，縮短了分析的時(shí)間，節(jié)省流動(dòng)相，提高了分析靈敏度。本研究采用HPLC-MS法測定了異葉天南星中L-瓜氨酸的含量，所建立的檢測方法簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好。

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