基于對氨基苯硼酸修飾磁性納米粒子及絲網(wǎng)印刷技術(shù)測定糖化血紅蛋白

廖曉棠，廖明媚

(1.中南大學(xué) 湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點實驗室，湖南 長沙 410008；2.湖南省藥品審評認證與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，湖南 長沙 410013)

糖化血紅蛋白(HbA1c)是葡萄糖與人體血液中紅細胞β-鏈纈氨酸N末端通過非酶促反應(yīng)結(jié)合的產(chǎn)物[1-2]，由于該反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，與血糖濃度成正比，能反映2～3個月血糖的平均水平，因此臨床上通過測定HbA1c了解患者血糖的控制情況，也是糖尿病等診斷非常重要的指標[3-5]。

HbA1c的檢測方法主要有陽離子交換色譜法、電泳法、親和層析法、免疫分析法、離子層析法和酶法等[6-9]。高效液相色譜法作為檢測HbA1c的金標準，準確度高，但預(yù)處理、周轉(zhuǎn)時間長，操作復(fù)雜，儀器和檢測成本高，不利于推廣。目前臨床采用酶法，其原理為將HbA1c的β亞單位進行水解，利用酶促反應(yīng)氧化果糖酰纈氨酸檢測過程中生成的過氧化氫[10]；但該方法受到色原物質(zhì)和樣品自身顏色的干擾，易產(chǎn)生誤差。電化學(xué)方法具有靈敏度高以及不受樣品自身顏色干擾的特點，且基于絲網(wǎng)印刷技術(shù)的電化學(xué)傳感器具有成本低、易操作以及便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，具有較大的發(fā)展前景[11-14]。

圖1 糖化血紅蛋白的檢測原理圖Fig.1 Schematic diagram of the glyeosylated hemoglobin detection

網(wǎng)狀玻璃態(tài)碳(RVC)由玻璃態(tài)碳泡沫構(gòu)成，孔隙率達90%～97%，該多孔材料比表面積大，對液體流動的阻力小，適用于流動注射系統(tǒng)[15-16]。由于硼酸基團能與HbA1c中的順位二醇基結(jié)合，本實驗通過對氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子捕獲樣本中的糖化血紅蛋白。在絲網(wǎng)印刷電極表面采用殼聚糖和正硅酸乙酯作為碳納米管的分散劑，將納米管固定形成溶膠-凝膠膜后用于血紅蛋白和糖化血紅蛋白的直接電化學(xué)檢測。其反應(yīng)原理如圖1所示，當全血加入對氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子(MNP)溶液中后，HbA1c與磁性納米粒子結(jié)合，注射至流動池中，在磁性作用下，HbA1c與MNP共同吸附在RVC電極上，而游離的Hb在絲網(wǎng)印刷電極(SPE)被電化學(xué)檢測，當移除磁體時，HbA1c隨緩沖溶液流入至SPE表面而被電化學(xué)檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；LC-400P絲網(wǎng)印刷機(東莞聯(lián)昌實業(yè)有限公司)。FeCl2、FeCl3、對氨基苯硼酸、羧甲基葡聚糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基磺酸鈉(SDS)均購于Sigma公司；氯化銀漿購自徐州英劍納米科技有限公司；導(dǎo)電碳漿和絕緣油墨購自日本十條公司。所有溶液均用二次去離子水配制。

1.2 對氨基苯硼酸修飾磁性納米粒子的制備

圖2 對氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子的透射電鏡形貌圖Fig.2 TEM image of magnetic nanoparticles modified with 3-aminophenylboronic acid

將10 mL 0.05 mmol/L的 FeCl2和10 mL 0.10 mmol/L 的FeCl3溶液倒入三口燒瓶中，加入50 mL 5 mg/mL的羧甲基葡聚糖溶液，通入氮氣，再滴加28%的氨水3 mL。室溫下將混合溶液超聲處理10 min，升溫至80 ℃反應(yīng)60 min，將樣品洗滌至中性，冷凍干燥，得到羧甲基葡聚糖改性磁性納米粒子。取4 mg/mL磁性納米粒子溶液1 mL，加入5 mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和5 mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的PBS溶液中，混合均勻，室溫下活化羧基3 h，磁場下分離，分離后用去離子水洗滌磁性納米粒子，加入1 mL的PBS溶液(pH 7.2)，將其放入10 mmol/L 對氨基苯硼酸溶液中反應(yīng)1 h，并加入5 mmol/L甘氨酸溶液以封閉RVC上未參與反應(yīng)的羧基，用PBS反復(fù)清洗，加入1 mL 100 mmol/L pH 9.0 的2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、1%聚乙二醇辛基苯基醚和0.45%SDS，在4 ℃保存。對氨基苯硼酸修飾磁性納米粒子在pH 9.0條件的Zeta電位為-32 mV，分散性較好，不易團聚，粒徑約為150 nm，圖2為其透射電鏡形貌圖(TEM)。

1.3 電極的制備

將RVC制成直徑3 mm、長5 mm的工作電極，塞入至特氟龍制成的圓柱狀流動池中。絲網(wǎng)印刷電極含有1個工作電極和1個參比電極。將氯化銀漿印制在聚酯膜上，75 ℃烘干10 min，形成對比電極；將碳漿印制在聚酯膜上另一端，110 ℃烘干15 min，形成工作電極，在對比電極和工作電極之間印制一層絕緣油墨，75 ℃烘干10 min，固定絲網(wǎng)印刷電極的反應(yīng)區(qū)。將絲網(wǎng)印刷電極反應(yīng)區(qū)浸入10 μL含有CS、TEOS和碳納米管(質(zhì)量比1∶1∶1)的混合溶液中放置1 h，于45 ℃干燥10 min，室溫干燥保存。由于RVC具有較大的表面積，當加置磁體時，對氨基苯硼酸修飾磁性納米粒子結(jié)合的HbA1c能有效地吸附在RVC電極表面，可通過循環(huán)伏安法(CV)對下游的絲網(wǎng)印刷電極進行表征。通過檢測不同濃度的Hb氧化反應(yīng)電流，重復(fù)性偏差在2%以內(nèi)。

1.4 臨床樣本測試

將采集的5 mL靜脈血液置于肝素鈉的抗凝管中，取其中1份用全自動生化儀進行酶法測試。另取10 μL加入10 μL含對氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子、2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚和0.45%SDS的溶血劑，反應(yīng)10 s后注入RVC流動池中，利用I～t方法測定樣本中Hb和HbA1c的電量，通過電量比計算HbA1c的比例。

2 結(jié)果與討論

2.1 Hb與HbA1c在絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)行為

圖3 掃描速度為100 mV/s時絲網(wǎng)印刷電極在不同溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of various solution at the screen printed electrode with scan rate of 100 mV/sa：100 mg/mL hemoglobin；b：2 mg/mL glyeosylated hemoglobin；c：PBS solution

采用循環(huán)伏安法(CV)研究了對血紅蛋白(Hb)和糖化血紅蛋白(HbA1c)在殼聚糖(CS)、正硅酸乙酯(TEOS)和碳納米管構(gòu)成的溶膠-凝膠膜修飾絲網(wǎng)印刷電極上的電化學(xué)行為。由于Hb是一種亞血紅素蛋白質(zhì)，含有4個含鐵的亞鐵血紅素，而鐵離子包埋在Hb內(nèi)部，電活性中心很難到達電極表面，因此很難在電極表面發(fā)生直接的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)。碳納米管則具備高電導(dǎo)性，能促進電子的轉(zhuǎn)移速率，利用TEOS 和CS進行交聯(lián)將碳納米管覆蓋在絲網(wǎng)印刷電極表面后，能促進Hb和HbA1c中亞鐵血紅素的電子轉(zhuǎn)移。如圖3所示，100 mg/mL 的Hb在-0.70～0.10 V范圍內(nèi)呈現(xiàn)1對較好的氧化還原峰，氧化、還原峰電位分別為-0.20 V和-0.35 V;2 mg/mL HbA1c的氧化、還原峰電位分別為-0.24 V和-0.34 V。該氧化還原峰主要由亞鐵血紅素在絲網(wǎng)印刷電極表面發(fā)生的氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生，表明碳納米管能夠促進亞鐵血紅素和絲印電極之間的電子傳遞，且Hb和HbA1c在絲印電極上發(fā)生了直接氧化還原反應(yīng)。

2.2 絲網(wǎng)印刷電極的抗干擾性

電化學(xué)方法測定實際血樣時，電化學(xué)響應(yīng)常受其他氧化還原物質(zhì)的干擾，如尿酸(UA)和抗壞血酸(AA)。這些物質(zhì)通常與介體具有相近的氧化還原電位。因此，考察了在生理條件下，0.03 mg/mL的UA和0.03 mg/mL AA對CS、TEOS和碳納米管修飾絲網(wǎng)印刷電極測定Hb的干擾。當電位大于0.10 V時，UA和AA在絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)響應(yīng)信號隨著電位的升高而增大，該信號主要歸結(jié)于UA和AA在電極表面的直接氧化還原反應(yīng)。當電位在-0.10～0.10 V時，電化學(xué)響應(yīng)信號基本不變，而低于-0.10 V時，電化學(xué)響應(yīng)信號則隨著電位的升高而增加，表明Hb在電極表面氧化反應(yīng)不完全。其他干擾物質(zhì)(如多巴胺、對乙酰氨基酚和膽紅素)在0.10 V 的電位下均不會對絲網(wǎng)印刷電極產(chǎn)生影響。同時考察了不同濃度干擾物質(zhì)對電極的影響，結(jié)果表明僅抗壞血酸濃度高于0.1 mg/mL時對電極產(chǎn)生干擾，這主要是由于高濃度的抗壞血酸吸附在RVC電極表面所致，當提高流動注射的速率時，干擾逐漸降低，而其他物質(zhì)均無影響。因此，在0.10 V測定Hb的氧化還原基本不受血液樣本中氧化還原物質(zhì)的干擾，具有較好的抗干擾能力，該方法可用于實際樣本中HbA1c和Hb濃度的檢測。

2.3 Hb及HbA1c濃度與絲網(wǎng)印刷電極反應(yīng)的電量關(guān)系

研究顯示，絲網(wǎng)印刷電極電位為0.1 V時，隨著Hb和HbA1c濃度的增大，電流增加，且Hb質(zhì)量濃度在30～240 mg/mL范圍時，電量(Q,10-4C)與Hb的質(zhì)量濃度(mg/mL)呈較好的線性關(guān)系，校正曲線方程為Q=0.017 [Hb]+1.16，相關(guān)系數(shù)r=0.997 0，信噪比為3時的檢出限為6 mg/mL。由于磁性納米粒子具有較好的富集作用，當HbA1c與磁性納米粒子的修飾基團對氨基苯硼酸結(jié)合，通過RVC流動池時，由于磁性作用，HbA1c在RVC中富集，當磁性消失時，HbA1c流動到絲網(wǎng)印刷電極表面從而被檢測。當HbA1c質(zhì)量濃度為0.4～20.0 mg/mL時，其與電量(10-4C)之間存在良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Q=0.048[HbA1c]+0.52，信噪比為3時的檢出限為0.05 mg/mL。

2.4 絲網(wǎng)印刷電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

為了測試摻雜CS、TEOS和碳納米管構(gòu)成的溶膠-凝膠膜修飾絲網(wǎng)印刷電極的重復(fù)性和穩(wěn)定性，使用HbA1c與Hb濃度比例為5.5%的標準品進行測試，連續(xù)測試10次，結(jié)果表明不同的絲網(wǎng)印刷電極具有較好的重現(xiàn)性，相對標準偏差(RSD)為3.3%。

將同一批次的絲網(wǎng)印刷電極干燥保存在室溫下，RVC流動池通過注射純化水進行保存，每隔7 d對絲網(wǎng)印刷電極進行測試。35 d后絲網(wǎng)印刷電極測得HbA1c濃度減少0.21%，表明該電極具有較好的穩(wěn)定性，這主要是由于RVC和溶膠-凝膠包覆的碳納米管具有較好的穩(wěn)定性。

圖4 實際樣品的安培響應(yīng)圖Fig.4 Amperometric responses of the real sample detectiona.the response of Hb at the screen printed electrode when install the magnet;b.the response of HbA1c at the screen printed electrode when remove the magnet

2.5 實際樣品的測試

將采集的2 mL靜脈血液置于含有肝素鈉的抗凝管中，取其中1份用全自動生化儀進行酶法測試。另取10 μL加入10 μL含有對氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子、2-(環(huán)己胺)-1-乙磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚和0.45%SDS的溶血劑，反應(yīng)10 s后注射到RVC流動池中，如圖4a所示，當加入磁性物質(zhì)時，絲網(wǎng)印刷電極響應(yīng)為Hb的氧化反應(yīng)電流;當反應(yīng)電流趨于平衡時移除磁性物質(zhì)，絲網(wǎng)印刷電極出現(xiàn)較大的電流響應(yīng)，主要是HbA1c在電極的氧化反應(yīng)(圖4b)，利用I～t方法可測出樣本中HbA1c的比例。

由表1可知，電化學(xué)測定的結(jié)果和醫(yī)院常用方法(全自動生化儀)的測定結(jié)果基本一致，表明該絲網(wǎng)印刷電極能有效地對全血樣品中的HbA1c進行檢測?；诹鲃幼⑸浜徒z網(wǎng)印刷電極的HbA1c生物傳感器成本低，操作簡便，能滿足臨床應(yīng)用的需求。

表1 電化學(xué)方法和全自動生化儀測定血液樣品中的 HbA1c含量的比較Table 1 Comparison of content of HbA1c determined by hospital and this method (%)

3 結(jié) 論

本文制備了對氨基苯硼酸修飾的磁性納米粒子以及殼聚糖(CS)、正硅酸乙酯(TEOS)和碳納米管構(gòu)成的溶膠-凝膠膜修飾絲網(wǎng)印刷電極，實現(xiàn)了對血紅蛋白(Hb)和糖化血紅蛋白(HbA1c)的電化學(xué)檢測。在0.10 V電位下，絲網(wǎng)印刷電極的電量與HbA1c和Hb的質(zhì)量濃度有較好的線性關(guān)系，檢出限分別為6 mg/mL和0.05 mg/mL。該傳感器采用非酶電極且無需抗體修飾，有效降低了成本，能實現(xiàn)HbA1c分析的重復(fù)利用，且與同類HbA1c電化學(xué)傳感器相比，該方法能同時測量HbA1c和Hb的濃度，有效排除抗壞血酸(UA)和尿酸(AA)的干擾，具有較好的穩(wěn)定性和準確度，具備測定HbA1c的臨床應(yīng)用潛力。

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