基于α-葡萄糖苷酶抑制率的樺褐孔菌多糖提取工藝優(yōu)化

王昭潤(rùn),劉 萍,榮瑞芬,吳曉彤*

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；3.北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院,北京 100023)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又稱白樺茸,是生長(zhǎng)在白樺樹(shù)上的真菌,主要分布在北緯45～50°的地區(qū)(如北美北部,芬蘭,俄羅斯,中國(guó)黑龍江、吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)等［1］)。其是一種食藥型真菌［2］,16世紀(jì)東歐一些國(guó)家的民間就用這種菌的菌核來(lái)防治癌癥［3］,俄羅斯Komsomlshi制藥公司發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌精粉對(duì)糖尿病的治愈率為93%［4］。隨著對(duì)樺褐孔菌化學(xué)成分研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌含有多種具有生物活性的成分(如多糖、三萜類化合物、木脂素、樺褐孔菌醇、黑色素等［5-6］),其中樺褐孔菌多糖是中藥多糖的一種,幾乎無(wú)毒副作用［7］,因具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)［8-12］等多種生物活性而受到廣泛研究,但前人對(duì)樺褐孔菌多糖降血糖活性研究較少,本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌多糖具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,α-葡萄糖苷酶抑制率可作為降血糖的活性考察指標(biāo)。目前真菌多糖的提取方法主要有熱水浸提法、堿提法、酸提法、酶提法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等［15］。在樺褐孔菌多糖的提取中,通常以多糖提取率為考察指標(biāo)［16-18］,而忽略了對(duì)多糖生物活性的評(píng)價(jià),這可能會(huì)影響高活性多糖的提取。響應(yīng)面優(yōu)化法(response surface methodology,RSM)是通過(guò)合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)［19］。目前該方法已被廣泛地應(yīng)用于食品、化學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域［20-22］。為了獲得具有高α-葡萄糖苷酶抑制率的樺褐孔菌多糖,本試驗(yàn)以樺褐孔菌多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率及提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面試驗(yàn)法對(duì)樺褐孔菌多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以期為樺褐孔菌多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌：大興安嶺品味食品有限公司,粉碎后過(guò)40目篩,陰涼干燥處保存待用；對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,pNPG)：美國(guó)Sigma公司；96孔酶標(biāo)板：美國(guó)Corning公司；透析袋(截留分子質(zhì)量3 500 Da,50 mm×5 m)：北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；層析柱(2.6 cm×25 cm)：上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16C離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810紫外分光光度計(jì)：上海棱光科技有限公司；BT-200B真空泵：鄭州恒巖儀器有限公司；M200 pro多功能酶標(biāo)儀：Tecan集團(tuán)奧地利有限公司；N-1000-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州恒巖儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

稱取5 g樺褐孔菌子實(shí)體粉末,按照一定的料液比加入去離子水,在一定的溫度條件下水提,提取完成后,取混合溶液離心(10 min、4 000 r/min),收集上清液,在60℃條件下,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適當(dāng)體積,加入無(wú)水乙醇,4℃過(guò)夜醇沉后8 000 r/min離心10 min,收集沉淀,于烘箱中50℃干燥,至質(zhì)量恒定即得水提多糖。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在提取溫度90℃,提取時(shí)間為4h,料液比為1∶25(g∶mL),醇沉倍數(shù)為3倍的條件下,固定其他3因素,分別考察不同提取溫度(30℃、50℃、70℃、90℃、95℃),提取時(shí)間(2 h、3 h、4 h、5 h、6 h),料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g∶mL)),醇沉倍數(shù)(2、3、4、5)對(duì)高活性多糖提取工藝的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用Design Expert 8.0.5中的Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)法,選擇提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)和提取料液比(C)3個(gè)因素,進(jìn)行3因素3水平分析試驗(yàn)。以多糖提取率(Y1)和α-葡萄糖苷酶抑制率(Y2)為響應(yīng)值,每個(gè)試驗(yàn)組合重復(fù)3次,優(yōu)化多糖提取工藝,響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1。

1.3.4 測(cè)定方法

總糖的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)［23］的方法測(cè)定樣品總糖含量。

粗多糖提取率的測(cè)定：紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)485nm處的吸光度值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)含量,計(jì)算粗多糖含量。粗多糖提取率的計(jì)算公式如下：

式中：yt為粗多糖的提取率,%；w0為樺褐孔菌的質(zhì)量,g；w1為測(cè)定多糖的質(zhì)量,g。

α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)［24］的方法略加修改,計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

提取時(shí)間對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知,多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率均隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高,提取3 h時(shí),多糖提取率較高,為4.03%；3h后多糖提取率變化較小,保持在4.03%～4.09%；α-葡萄糖苷酶抑制率在提取3 h時(shí)迅速升高至85.73%,之后仍緩慢升高,提取5 h時(shí)達(dá)到最高為88.98%。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3 h以后,多糖提取率和粗多糖α-葡萄糖苷酶抑制率變化均較小,而隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),其他小分子活性物質(zhì)的含量也會(huì)相應(yīng)提高,會(huì)降低多糖在溶液中的比例,增加后期多糖分離純化的難度。因此選擇提取時(shí)間3 h最為適宜。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

提取溫度對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

由圖2可知,提取溫度為30～90℃時(shí),多糖提取率及α-葡萄糖苷酶抑制率均隨溫度的升高呈現(xiàn)快速升高趨勢(shì)。提取溫度為90℃時(shí)多糖提取率及α-葡萄糖苷酶抑制率分別為4.41%和86.73%；提取溫度高于90℃之后,多糖提取率略微下降,α-葡萄糖苷酶抑制率變化不大。因此選擇提取溫度90℃最為適宜。

2.1.3 料液比對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

提取過(guò)程中料液比對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知,料液比為1∶15～1∶40(g∶mL)時(shí),隨著提取溶劑量增加,多糖提取率逐漸增加,料液比為1∶30(g∶mL)時(shí),多糖提取率最高,為4.02%；料液比＞1∶30(g∶mL)后提取率不再增加,表明多糖提取完全。提取料液比對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響作用并不明顯,基本保持在80%左右。由此判斷,多糖提取率與多糖活性之間并非存在正比關(guān)系,單一以多糖提取率為指標(biāo)研究提取工藝存在一定的局限性,同時(shí)以多糖活性為多糖提取工藝考察指標(biāo),更具有全面性和有效性。因此選擇提取料液比為1∶30(g∶mL)最為適宜。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

2.1.4 醇沉倍數(shù)對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

圖4 醇沉倍數(shù)對(duì)多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.4 Effect of alcohol precipitation multiple on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

提取過(guò)程中醇沉倍數(shù)對(duì)多糖提取率和粗多糖α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知,隨著醇沉倍數(shù)增加,多糖提取率有所增加,而α-葡萄糖苷酶抑制率略有下降趨勢(shì),但變化幅度都不大,多糖提取率在3.5%～4.0%,α-葡萄糖苷酶抑制率在80%～85%。醇沉倍數(shù)為3倍時(shí),多糖提取率最高,但此時(shí)α-葡萄糖苷酶抑制率較醇沉倍數(shù)為2倍時(shí)低,醇沉倍數(shù)增加,能獲得更多的多糖,但不一定是具備α-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖,同時(shí)推測(cè)具備α-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖對(duì)醇溶液濃度有選擇性。因此選定醇沉倍數(shù)為2倍最為適宜。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化提取樺褐孔菌多糖工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)和提取料液比(C)為自變量,固定醇沉倍數(shù)為2倍,以多糖提取率(Y1)和α-葡萄糖苷酶抑制率(Y2)為響應(yīng)值進(jìn)行3因素3水平分析試驗(yàn)。試驗(yàn)共有17組,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for polysaccharide extraction process optimization

2.2.2 多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到多糖提取率(Y1)和α-葡萄糖苷酶抑制率(Y2)的回歸模型：

Y1=4.31+0.32A+0.005 25B+0.087C+0.083AB-0.048AC+0.083BC-0.11A2-0.2B2-0.017C2

Y2=90.34+7.67A+0.66B+0.59C+0.26AB+0.055AC+1.27BC-5.65A2-2.08B2-1.81C2

回歸方程的方差分析見(jiàn)表4、表5。從表4可以看出,多糖提取率Y1回歸模型極顯著(P＜0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),說(shuō)明該模型可以擬合試驗(yàn)結(jié)果。決定系數(shù)R2=0.9041,說(shuō)明模型響應(yīng)值的變化有90.41%來(lái)自所選因變量,因此,該回歸方程可以描述各因素對(duì)多糖提取率的影響。該模型一次項(xiàng)A影響極顯著(P＜0.01)。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

從表5可以看出,α-葡萄糖苷酶抑制率Y2模型極顯著(P＜0.01)。Y2模型失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),該模型選擇合適。Y2模型的校正決定系數(shù)R2為0.990 1,說(shuō)明模型響應(yīng)值的變化有99.01%來(lái)自所選因變量,進(jìn)一步說(shuō)明模型擬合優(yōu)度較好。因此該回歸方程可以描述各因素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。該模型一次項(xiàng)A,二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著(P＜0.01),交互項(xiàng)BC影響顯著(P＜0.05)。

表5 α-葡萄糖苷酶抑制率回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model forα-glucosidase inhibition rate

2.2.3 響應(yīng)曲面圖分析

響應(yīng)值Y1和Y2與3個(gè)因素A、B、C構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5～圖6。

圖5 提取溫度、提取時(shí)間和料液比交互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between extraction temperature,time and solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

圖6 提取溫度、提取時(shí)間和料液比交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between extraction temperature,time and solid-liquid ratio on α-glucosidase inhibition rate

由圖5可知,提取溫度對(duì)多糖提取率影響顯著,隨著提取溫度的升高,多糖提取率上升趨勢(shì)逐漸變緩,而隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖提取率先上升后保持穩(wěn)定；多糖提取率隨著提取料液比和提取溫度的增加(升高)而不斷增加,其中提取溫度的影響更為顯著；提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響比提取料液比顯著,因?yàn)榍罢叩淖兓厔?shì)更為明顯。多糖提取率隨提取時(shí)間的增加先上升后下降,并且當(dāng)提取料液比越大時(shí),這種趨勢(shì)越明顯。

由圖6可知,α-葡萄糖苷酶抑制率隨提取溫度的升高而不斷增加,隨提取料液比的變化α-葡萄糖苷酶抑制率變化不明顯。這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致；提取溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響顯著,隨著提取溫度的升高,α-葡萄糖苷酶抑制率先上升后保持穩(wěn)定,而提取時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響較低；α-葡萄糖苷酶抑制率隨著提取時(shí)間和提取料液比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì),當(dāng)提取時(shí)間為3 h,提取料液比為1∶30(g∶mL)時(shí),有最大的α-葡萄糖苷酶抑制率。

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

結(jié)合實(shí)際情況與響應(yīng)面優(yōu)化所得最佳條件,確定提取時(shí)間為3.5 h,提取溫度為95℃,提取料液比為1∶30(g∶mL),在此條件下進(jìn)行多糖提取,并對(duì)多糖提取率和單位濃度多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率進(jìn)行測(cè)定,在此條件下,3次多糖提取率平均值為4.61%,α-葡萄糖苷酶抑制率平均值為92.34%,與理論值相差1.5%和0.47%,因此,響應(yīng)面法所得樺褐孔菌多糖提取條件的回歸方程模型是可行的,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究以α-葡萄糖苷酶抑制率和多糖提取率為考察指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化多糖提取工藝,得出高活性樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝為提取溫度95 ℃,提取時(shí)間3.5 h、提取料液比1∶30(g∶mL),醇沉倍數(shù)2倍,在此條件下,多糖提取率為4.61%,α-葡萄糖苷酶抑制率為92.34%,

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首先，應(yīng)當(dāng)以學(xué)校為主體創(chuàng)設(shè)綜合信息管理平臺(tái)，以便依托該信息平臺(tái)實(shí)現(xiàn)家校共育。同時(shí)，在該平臺(tái)的建設(shè)過(guò)程之中，必須引入外部評(píng)價(jià)機(jī)制，改變以往的校內(nèi)單一評(píng)價(jià)模式，依托現(xiàn)代通訊技術(shù)搭建家庭教育同學(xué)校教育之間的溝通橋梁。

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