植物乳桿菌生物合成苯乳酸條件優(yōu)化研究

李明華,孟秀梅,2

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術學院,江蘇 淮安 223003；2.江蘇食品加工工程技術研究開發(fā)中心,江蘇 淮安 223003)

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)又被稱為β-苯乳酸或3-苯基乳酸,是一種安全、高效的生物防腐劑,能夠廣泛抑制食品中致病性及腐敗性微生物的生長繁殖［1］。與其他生物防腐劑相比,苯乳酸還具有諸多優(yōu)點,如易溶、易在食品中擴散、對酸和熱穩(wěn)定性高等［2］,可廣泛應用于食品加工行業(yè)中。

目前,已發(fā)現(xiàn)多個種屬的微生物可合成苯乳酸,如白地霉［3］、丙酸菌［4］、片球菌［5-6］、芽孢桿菌［7］和乳酸菌等［8］。其中,作為重要的益生菌,乳酸菌應用歷史悠久且安全性高,已成為合成苯乳酸的研究熱點。近年來,已有多名學者應用干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)［9］、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)［10］和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)［11-12］等乳酸菌菌株發(fā)酵合成苯乳酸,產(chǎn)量多在2.0 g/L以下。在微生物發(fā)酵過程中,發(fā)酵液成分復雜,產(chǎn)物后期提取困難,且高濃度的底物和產(chǎn)物都可抑制菌體生長,最終影響到苯乳酸產(chǎn)量。而靜息細胞轉化法是在反應體系中,以微生物細胞作為催化劑,將外源底物進行結構修飾的一種轉化方法。在靜息細胞轉化過程中,菌體不再生長繁殖,反應體系副產(chǎn)物少,產(chǎn)物易分離純化,且反應專一性強、轉化效率高、反應時間短,反應條件更易控制［13］。本研究嘗試應用植物乳桿菌靜息細胞作為催化劑,轉化苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)合成苯乳酸,并對其反應條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及試劑

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)RF-16：分離自泡菜中［14］,于本實驗室保存；苯乳酸標準品、苯丙酮酸(分析純),三氟乙酸(色譜純)：上海阿拉丁試劑公司；甲醇(色譜純)：德國默克公司；其他主要化學試劑為市售分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母膏5.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,NaAc·3H2O 5.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,檸檬酸三銨2.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,吐溫-80 1 mL,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,pH 6.2～6.4。在以上液體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉即為MRS固體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DNP-9052恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；ZD-85A恒溫振蕩器：金壇科析儀器有限公司；TGL-20C高速冷凍離心機：上海新拓公司；LC-20AB液相色譜儀：日本島津公司；Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)：美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將-20℃冰箱內(nèi)保存的植物乳桿菌菌種劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基平板上,30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至長出菌落,相同條件下轉接一次,然后挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)20 h備用。

1.3.2 靜息細胞制備

將活化的菌種按體積分數(shù)1%的比例接種于含200 mL MRS培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)16 h,然后于4℃、8 000 r/min條件下離心10 min,菌體用50 mmol/L、pH6.5的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer saline,PBS)洗滌兩遍,即制得植物乳桿菌靜息細胞。

1.3.3 靜息細胞轉化方法

在100 mL三角瓶中,將緩沖液、苯丙酮酸和靜息細胞按一定比例配制成15 mL反應液,密封后置于恒溫振蕩器中120r/min條件下進行轉化反應,反應一定時間后取樣,測定上清液中苯乳酸含量。

1.3.4 單因素試驗

在15 mL反應體系中,分別在不同轉化溫度、轉化pH、靜息細胞質(zhì)量濃度、苯丙酮酸質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度的條件下,反應一定時間后,取樣測定苯乳酸含量,確定不同因素對苯乳酸產(chǎn)量的影響。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上,以靜息細胞質(zhì)量濃度、苯丙酮酸質(zhì)量濃度、葡萄糖濃度和轉化時間為考察因素,以苯乳酸產(chǎn)量為考察指標,設計4因素3水平正交試驗,因素與水平如表1所示。

表1 苯乳酸轉化條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for transformation conditions optimization of phenyllactic acid

1.3.6 苯乳酸含量測定方法

按照參考文獻［15］,流動相A、B分別為0.05%的三氟乙酸甲醇溶液和0.05%的三氟乙酸水溶液。樣品按如下程序洗脫：0～20 min,流動相A 10%～100%,20～23 min保持100%；24～25 min,流動相A 100%～10%。流動相流速1.0mL/min,檢測波長210nm,柱溫30℃,樣品上樣量10μL。

2 結果與分析

2.1 不同因素對苯乳酸產(chǎn)量的影響

2.1.1 不同菌齡對苯乳酸產(chǎn)量的影響

靜息細胞生物轉化在本質(zhì)上為酶催化的生化反應,細胞內(nèi)相應酶的含量和活性直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量。因菌體在不同生長階段相應酶的表達水平差別較大,因此首先要確定不同菌齡細胞的催化活性。在靜息細胞質(zhì)量濃度100g/L、底物質(zhì)量濃度4.0 g/L、pH6.5的反應體系中,于120 r/min、35℃的條件下?lián)u床轉化6 h,苯乳酸產(chǎn)量如圖1所示。

圖1 菌齡對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of bacterial age on phenyllactic acid yield

由圖1可知,在菌體培養(yǎng)至15～20 h時,苯乳酸產(chǎn)量達到最高,說明該段菌齡細胞內(nèi)乳酸脫氫酶活性最大,考慮到菌株RF-16在培養(yǎng)至16 h時達到穩(wěn)定期［14］,細胞得率最高,因此后續(xù)試驗均采用菌齡為16h的靜息細胞進行催化。

2.1.2 靜息細胞濃度對苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖2 靜息細胞質(zhì)量濃度對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of cell concentration on phenyllactic acid yield

在酶催化反應中,產(chǎn)物產(chǎn)量除了與酶活性相關外,與酶的濃度也有直接關系。在靜息細胞反應體系內(nèi),細胞濃度決定了酶的濃度。由圖2可知,隨著靜息細胞質(zhì)量濃度的提高,苯乳酸產(chǎn)量也隨之增加,在靜息細胞質(zhì)量濃度為80 g/L時,苯乳酸產(chǎn)量達到最高,為1.31 g/L。但靜息細胞質(zhì)量濃度＞100 g/L時,可能由于傳質(zhì)限制,影響了酶的催化反應,致使苯乳酸產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢。因此選擇靜息細胞質(zhì)量濃度60 g/L、80 g/L、100 g/L進行正交試驗。

2.1.3 苯丙酮酸濃度對苯乳酸產(chǎn)量的影響

在靜息細胞質(zhì)量濃度為80 g/L,pH為6.5,底物質(zhì)量濃度分別為1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L的反應體系中,35℃轉化6 h,苯乳酸的產(chǎn)量如圖3所示。

圖3 苯丙酮酸質(zhì)量濃度對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of PPA concentration on phenyllactic acid yield

由圖3可知,隨著苯丙酮酸質(zhì)量濃度的提高,苯乳酸產(chǎn)量隨之提高,但苯丙酮酸質(zhì)量濃度＞2.0 g/L后,苯乳酸產(chǎn)量增加緩慢；苯丙酮酸質(zhì)量濃度＞4.0 g/L后,苯乳酸產(chǎn)量逐漸降低,可能是底物抑制了轉化反應所致。因此選擇苯丙酮酸質(zhì)量濃度2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L進行正交試驗。

2.1.4 葡萄糖質(zhì)量濃度對苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖4 葡萄糖質(zhì)量濃度對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of glucose concentration on phenyllactic acid yield

在植物乳桿菌細胞內(nèi),催化苯丙酮酸合成苯乳酸的酶為NADH依賴性乳酸脫氫酶［16］,NADH的供應將直接影響苯乳酸的產(chǎn)量。為提供充足的NADH,除了直接在反應體系中添加或在細胞內(nèi)構建輔酶再生體系外［17］,還可通過在靜息細胞反應體系中添加輔助底物的方式構建與細胞自身代謝過程藕合的輔酶再生系統(tǒng),其中葡萄糖即為常用的輔助底物之一［18-19］。在靜息細胞質(zhì)量濃度為80 g/L,pH為6.5,苯丙酮酸質(zhì)量濃度為3.0 g/L的反應體系中分別添加不同濃度的葡萄糖,35℃轉化6 h,苯乳酸產(chǎn)量如圖4所示。由圖4可知,葡萄糖的添加顯著提高了苯乳酸的產(chǎn)量,在質(zhì)量濃度為8.0 g/L時,產(chǎn)物產(chǎn)量達到1.63 g/L,比未添加葡萄糖的反應體系提高了23.48%。但是,質(zhì)量濃度超過12.0g/L后,可能葡萄糖經(jīng)過代謝后改變了反應體系的pH,從而導致了苯乳酸產(chǎn)量下降。因此選擇葡萄糖質(zhì)量濃度4.0g/L、8.0g/L、12.0 g/L進行正交試驗。

2.1.5 轉化pH對苯乳酸產(chǎn)量的影響

在靜息細胞質(zhì)量濃度為80 g/L,苯丙酮酸和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為3.0 g/L和8.0 g/L的反應體系中,改變緩沖液的pH,35℃搖床內(nèi)轉化6 h,考察pH對苯乳酸產(chǎn)量的影響。由圖5可以看出,轉化pH對細胞催化反應有嚴重影響,pH≤5.5或≥7.5時,苯乳酸產(chǎn)量較低；而pH為6.0～7.0時,苯乳酸的產(chǎn)量較高,其中pH6.5時產(chǎn)量達到最高,為1.56 g/L,說明乳酸脫氫酶在該pH范圍內(nèi)催化活性較高。

圖5 轉化pH對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of conversion pH on phenyllactic acid yield

2.1.6 轉化溫度對苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖6 轉化溫度對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of conversion temperature on phenyllactic acid yield

在生物催化過程中,溫度一方面影響酶的催化活性,另一方面也可影響酶的穩(wěn)定性。為考察溫度對苯乳酸產(chǎn)量的影響,在靜息細胞質(zhì)量濃度為80 g/L,苯丙酮酸和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為3.0 g/L和8.0 g/L,pH為6.5的反應體系中,分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下進行轉化,結果如圖6所示。由圖6可知,隨著轉化溫度的升高,苯乳酸產(chǎn)量也隨之提高,在轉化溫度為35℃時,苯乳酸產(chǎn)量達到最高,為1.61 g/L；繼續(xù)提高反應溫度,苯乳酸產(chǎn)量逐漸降低,可能是因為高溫影響了酶的活性或穩(wěn)定性。

2.1.7 轉化時間對苯乳酸產(chǎn)量的影響

在靜息細胞質(zhì)量濃度為80g/L,苯丙酮酸和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為3.0 g/L和8.0 g/L,pH為6.5的反應體系中,35℃條件下轉化不同時間,比較苯乳酸產(chǎn)量,結果如圖7所示。由圖7可知,在轉化開始的2 h內(nèi),苯乳酸產(chǎn)量快速上升,轉化至2 h時,產(chǎn)量為1.31 g/L；隨后,苯乳酸產(chǎn)量緩慢上升,轉化至4 h時,基本達到穩(wěn)定,為1.63 g/L,進一步延長轉化時間,苯乳酸產(chǎn)量沒有明顯變化,可能因為產(chǎn)物的反饋抑制作用或反應體系pH的變化影響了轉化反應的進行,導致苯乳酸產(chǎn)量未進一步的提高。因此,在該反應體系及反應條件下,反應進行4 h后即可停止反應。因此選擇轉化時間3 h、4 h、5 h進行正交試驗。

圖7 轉化時間對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of conversion time on PLA yield

2.2 苯乳酸轉化的正交試驗優(yōu)化

在前人進行的苯乳酸生物轉化條件優(yōu)化試驗中,優(yōu)化后的最佳轉化pH和溫度往往和單因素試驗最佳值一致［12,20］,因此在本研究中,僅以靜息細胞濃度、苯丙酮酸濃度、葡萄糖濃度和轉化時間為試驗因子,以苯乳酸產(chǎn)量為考察指標,設計4因素3水平正交試驗進行優(yōu)化。試驗結果和方差分析分別見表2和表3。

由正交試驗分析結果可得,在4個影響苯乳酸產(chǎn)量的因素中,影響大小的順序為A＞D＞B＞C,即靜息細胞質(zhì)量濃度＞轉化時間＞苯丙酮酸質(zhì)量濃度＞葡萄糖質(zhì)量濃度；各因素最佳優(yōu)化條件為A2B2C1D2,即靜息細胞質(zhì)量濃度為8.0 g/L,苯丙酮酸質(zhì)量濃度為3.0 g/L,葡萄糖質(zhì)量濃度為4.0g/L,轉化時間為4 h。表3方差分析結果表明,靜息細胞質(zhì)量濃度對苯乳酸產(chǎn)量影響顯著(P＜0.05),而其他3因素影響不顯著。將以上正交試驗優(yōu)化的轉化條件進行3組平行試驗驗證,結果表明,苯乳酸平均產(chǎn)量為1.68 g/L,優(yōu)于正交試驗中的所有組合,說明此工藝條件合理,試驗重現(xiàn)性良好。

表2 苯乳酸轉化條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for phenyllactic acid conversion conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 細胞重復利用次數(shù)對苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖8 重復次數(shù)對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of repetition times on phenyllactic acid yield

將反應4 h后的靜息細胞4℃、8 000 r/min離心10 min后收集,在同樣的反應體系中進行催化反應,考察重復使用后細胞的催化活性,結果如圖8所示。結果表明,在靜息細胞催化過程中,第1～4批次細胞催化活性相對穩(wěn)定,苯乳酸產(chǎn)量分別為1.65g/L、1.56g/L、1.32g/L和1.35g/L,但在第5次催化中,苯乳酸產(chǎn)量顯著下降,為0.89 g/L,僅為初次反應的53.94%,這可能因為經(jīng)過多次操作后造成部分酶的失活,或輔酶NADH的再生無法滿足細胞催化反應所致。

3 結論

本研究采用植物乳桿菌靜息細胞作為催化劑,以苯丙酮酸為底物合成苯乳酸。經(jīng)過單因素試驗和正交優(yōu)化試驗,獲得了合成苯乳酸的最佳工藝條件為：轉化溫度35℃、pH 6.5、靜息細胞質(zhì)量濃度80 g/L、苯丙酮酸質(zhì)量濃度3.0 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度4.0 g/L、轉化時間4.0 h,在該條件下,苯乳酸產(chǎn)量為1.68 g/L,且細胞經(jīng)過4次重復利用,苯乳酸產(chǎn)量相對穩(wěn)定。此外,在本研究中,葡萄糖作為輔助底物,可在一定程度上提高輔酶NADH的再生能力［13］,從而顯著提高了苯乳酸的產(chǎn)量。

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