土壤中高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

耿 芳,楊紹青,閆巧娟,劉 軍,龔思怡,江正強(qiáng)*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院,北京 100083)

蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽鍵水解的一類酶,在食品、飼料、醫(yī)藥、化工等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用［1］。與動、植物來源蛋白酶相比,微生物蛋白酶具有培養(yǎng)簡便、易批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［2］,因此,微生物蛋白酶的研究一直備受關(guān)注。大部分商業(yè)中性和堿性蛋白酶都來源于細(xì)菌,目前,已報(bào)道產(chǎn)胞外蛋白酶的細(xì)菌種類很多［3］,常見的有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Aeruginosa)等。

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens),是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌,主要存在于沿海鹽堿土壤中,能夠產(chǎn)生紅色非擴(kuò)散性色素［4］。據(jù)報(bào)道,粘質(zhì)沙雷氏菌所產(chǎn)的堿性蛋白酶不僅可以有效消除芽孢菌酶制劑的弊端,而且還具有一定的抗腫瘤活性［5］。趙海霞等［6］從土壤中篩選出一株產(chǎn)膠原蛋白酶的粘質(zhì)沙雷氏菌,天然酶活為21.19 U/mL,具有較強(qiáng)消化牛皮的能力。WAN M等［7］從二甲基亞砜中分離出一株產(chǎn)耐有機(jī)試劑蛋白酶的菌株粘質(zhì)沙雷氏菌MH6,該菌在一定濃度的親水有機(jī)溶劑中仍可保持穩(wěn)定活性。這些研究表明粘質(zhì)沙雷氏菌蛋白酶在工業(yè)應(yīng)用上具有廣闊的前景。此外,粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素及靈桿菌脂多糖在醫(yī)藥行業(yè)有著重要的價(jià)值［8］,其作為菌種制劑又具有抑癌、抗菌等作用,在農(nóng)作物的災(zāi)害防治上效果顯著［9-10］。同時(shí)粘質(zhì)沙雷氏菌也是一種高產(chǎn)脂肪酶、幾丁質(zhì)酶的菌種,能夠有效降解水產(chǎn)品副產(chǎn)物［11］,具有很大的開發(fā)潛力［12］。

國外對粘質(zhì)沙雷氏菌蛋白酶的研究主要集中在酶的純化與性質(zhì)上。NAM M S等［13］純化得到大小約為50 kDa的堿性蛋白酶,比酶活力為289 U/mg；SALARIZADEH N等［14］在溫泉附近分離到一株產(chǎn)金屬蛋白酶的粘質(zhì)沙雷氏菌,其在55℃、pH 10.0條件下酶活力最高；SALAMONE PR等［15］從土壤中得到的粘質(zhì)沙雷氏菌來源蛋白酶,其酶活力高達(dá)865 U/mL。國內(nèi)報(bào)道的野生型粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的水平普遍偏低［16］,且關(guān)于粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化的研究較少。通常,液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的一些成分如碳源、氮源等對菌株產(chǎn)蛋白酶很大影響［17］。本試驗(yàn)從海南土壤中篩選得到一株高產(chǎn)蛋白酶的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CAUH83,對菌株CAUH83形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及16SrDNA序列分析,并對其產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件(碳源、氮源、pH、溫度、表面活性劑及發(fā)酵時(shí)間)進(jìn)行優(yōu)化,以期為該菌株所產(chǎn)蛋白酶的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。同時(shí),雖然蛋白酶的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)較為成熟,但為降低成本,對其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化以提高蛋白酶活力仍然有待進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品：海南火山群公園；粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)CAUH83：篩選自土壤樣品。

1.1.2 試劑

酪蛋白、Folin-酚：美國Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物：英國Oxoid公司；Triton X-100基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；r Taq DNA聚合酶：日本Takara公司；2 000bp DNA Marker：北京博邁德生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種篩選固體培養(yǎng)基：脫脂奶粉2.0%,瓊脂2.0%。

種子培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%,蛋白胨1.0%,葡萄糖2.0%,氯化鈉0.5%,磷酸氫二鉀0.7%,磷酸二氫鉀0.3%。

菌種發(fā)酵液體培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%,蛋白胨1.0%,葡萄糖2.0%,氯化鈉0.5%,磷酸氫二鉀0.7%,磷酸二氫鉀0.3%。

培養(yǎng)基滅菌條件：高壓蒸汽滅菌121℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DK-S24恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TU-1800PC紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；B104光學(xué)生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器一廠；T100型梯度聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction,PCR)擴(kuò)增儀：美國伯樂公司；JY-E型電泳儀：北京六一儀器廠；JY02G型凝膠成像儀：上海小原科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

撥開土壤表面,向下約10 cm處收集土樣。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

(1)菌株的初篩

取0.1 g土樣溶于1 mL無菌水中,稀釋10倍后取200μL混合液涂布于菌種篩選固體培養(yǎng)基上,于37℃靜置培養(yǎng)2d。

(2)菌株的復(fù)篩

挑取呈現(xiàn)透明圈的菌株,于菌種篩選固體培養(yǎng)基上37℃靜置培養(yǎng)2 d。經(jīng)分離純化后挑取單菌落接入菌種發(fā)酵液體培養(yǎng)基中,于200 r/min、37℃振蕩條件下培養(yǎng)2 d。發(fā)酵液經(jīng)離心后取上清液測定蛋白酶活力。

1.3.3 菌株的鑒定

菌株形態(tài)與生理生化鑒定：將分離純化好的菌株于篩選固體培養(yǎng)基上37℃靜置培養(yǎng)2 d,觀察該菌菌落形態(tài)。挑取單菌落涂片,經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并對該菌進(jìn)行生理生化的鑒定［4］。

分子生物學(xué)鑒定：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以菌株的基因組DNA為模板,采 用 16S rDNA通用引物27F(5‘-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3‘)、1492R(5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3‘),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增菌株的16SrDNA的部分基因序列。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸2 min,34次循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后,送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,使用MGEA 6.0軟件中的鄰接(neighborjoining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［18］。

1.3.4 蛋白酶活力的測定

粗酶液的制備：將單菌落接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行活化,取1%的種子液接種至液體培養(yǎng)基中,于200 r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)2 d,發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min,得到的上清液即為粗酶液。

蛋白酶活力的測定：采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》法。將1 mL粗酶液與1 mL底物(酪蛋白溶液)混合均勻,于40℃反應(yīng)10 min,然后加入2 mL三氯乙酸終止反應(yīng),12 000 r/min條件下離心3 min。在1 mL上清液中加入5 mL Na2CO3以及1 mL Folin-酚試劑,混合均勻后于40℃保溫20 min,采用紫外可見分光光度計(jì)于波長660 nm處測定吸光度值。以先加入三氯乙酸終止反應(yīng)的一組為對照組。

蛋白酶活力的定義：1個(gè)酶活力單位定義為每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量(U)。

1.3.5 粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83的產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件,考察碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時(shí)間對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響。

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,考察不同碳源(酒糟、麩皮、葡萄糖、蔗糖、乳糖、脫脂棉和可溶性淀粉)及碳源添加量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%)對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響?？疾觳煌?酵母提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕、大豆粉、干酪素、脫脂奶粉、尿素和硫酸銨)及氮源濃度(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%)對產(chǎn)蛋白酶的影響。設(shè)計(jì)2因素(碳源、氮源濃度)3水平正交試驗(yàn),以確定產(chǎn)蛋白酶最佳碳氮比。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值,考察培養(yǎng)基初始pH值(3、4、5、6、7、8、9、10)對產(chǎn)蛋白酶的影響,考察不同培養(yǎng)溫度(20℃、25℃、30℃、32℃、35℃、40℃)對產(chǎn)蛋白酶的影響。最后在上述最適條件下培養(yǎng)該菌株,確定最適發(fā)酵時(shí)間。

1.3.6 聚丙烯酰氨凝膠電泳及酶譜分析

參照LAEMMLIUK［19］的方法,將粗酶液與含有十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulfate,SDS)和二巰蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)的緩沖液混合均勻后于沸水中加熱5min,冷卻離心后上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測蛋白酶純度,并計(jì)算其分子質(zhì)量。

蛋白酶酶譜：參照J(rèn)IANGWB等［20］的方法。在電泳分離膠中加入0.1%的明膠作為底物,在含有2.5%Triton X-100的50mmol/LTris-HCl緩沖液中反應(yīng)30min后,置于50mmol/L Tris-HCl緩沖液中,37℃反應(yīng)2 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選、分離和鑒定

2.1.1 蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

從不同土壤中篩選獲得多株產(chǎn)蛋白酶的菌株,測定其蛋白酶活,結(jié)果見表1。由表1可知,通過比較這幾株菌的菌落直徑、水解圈比值以及發(fā)酵液的酶活力,篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶菌株CAUH83,該菌株初篩蛋白酶活力達(dá)到126U/mL。

表1 蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of protease-producing strains

2.1.2 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果

根據(jù)菌株CAUH83的菌落形態(tài)、革蘭氏染色以及生理生化反應(yīng)結(jié)果,按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行初步分類［21］,該菌產(chǎn)紅色菌落,菌落表面光滑,邊緣不規(guī)則,不透明,且粘性易挑起(見圖1),菌落形態(tài)與趙海霞等［6］報(bào)道的產(chǎn)膠原蛋白酶的沙雷氏菌(Serratiamarcescens)描述一致。

根據(jù)分離菌的菌落和菌體形態(tài)、革蘭氏染色以及生理生化反應(yīng),按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行初步分類［19］,生理生化特征見表2。由表2可知,菌株革蘭氏染色、產(chǎn)芽孢、精氨酸雙水解酶及葡萄糖、木糖、棉子糖、阿拉伯糖利用試驗(yàn)結(jié)果呈陰性；脂酶、DNA酶、明膠液化及蔗糖、乳糖利用試驗(yàn)結(jié)果呈陽性。

圖1 菌株CAUH83菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strain CAUH83

表2 菌株CAUH83生理生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics of strain CAUH83

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

圖2 菌株CAUH83基于16s rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Pylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain CAUH83

提取菌株CAUH83的基因組DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序后得到全長約1500bp的基因序列,在美國國家生物技術(shù)信息中心(ntional center of biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)比對可知,該菌株序列與粘質(zhì)沙雷氏菌的16SrDNA序列同源性高達(dá)99%。利用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖2。由圖2可知,該菌株CAUH83與粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)聚于一支,親緣關(guān)系最為接近。因此結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定結(jié)果,鑒定菌株CAUH83為一株粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

2.2 菌株CAUH83發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌株CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響

不同碳源(含量2%)對菌株CAUH83發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知,當(dāng)以蔗糖作為碳源時(shí),菌株CAUH83發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活性最高,蛋白酶活力為162.9 U/mL,其次為葡萄糖(159.6 U/mL)和可溶性淀粉(126.3 U/mL)。發(fā)酵過程中,蔗糖先分解為葡萄糖和果糖。果糖可以直接轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖,進(jìn)入糖酵解過程。因此,相對于葡萄糖,果糖更易代謝,能夠更加有效地提高菌體量［22］。因此,選擇蔗糖作為最適碳源。

圖3 不同碳源對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effects of different carbon resources on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

圖4 蔗糖添加量對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effects of sucrose addition on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

以蔗糖為碳源,研究不同蔗糖添加量對菌株產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知,蔗糖添加量對產(chǎn)酶的影響較為明顯,蔗糖添加量由1%增加到3%時(shí),酶活逐漸升高,當(dāng)蔗糖添加量為3%時(shí),蛋白酶的酶活力最高為238.8 U/mL,繼續(xù)增加蔗糖添加量時(shí),酶活力呈緩慢下降趨勢。因此選擇3%作為蔗糖的最適添加量。

2.2.2 氮源對菌株CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響

不同氮源(含量2%)對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知,氮源對菌株CAUH83產(chǎn)酶的影響大于碳源［23］,有機(jī)氮源更有利于菌株產(chǎn)酶,以大豆粉作為氮源時(shí),蛋白酶的酶活力最高為378.4U/mL,其次為脫脂奶粉與豆粕。從營養(yǎng)成分來看,大豆粉蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%,并且為優(yōu)質(zhì)蛋白。此外,大豆粉還富含各種氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分。因此,選擇大豆粉為最適氮源。

圖5 不同氮源對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶酶活的影響Fig.5 Effects of different nitrogen resources on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

確定大豆粉為最適氮源后,進(jìn)一步研究大豆粉的添加量對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響,結(jié)果見圖6。由圖6可知,當(dāng)大豆粉添加量為3%時(shí),蛋白酶酶活力最高,當(dāng)大豆粉的含量繼續(xù)增加時(shí),酶活力開始逐漸下降。因此,大豆粉最適添加量為3%。

圖6 大豆粉添加量對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.6 Effects of soybean flour addition on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對菌株CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響

液體發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始pH值對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知,隨著初始pH值升高,酶活力逐漸增大；當(dāng)初始pH值＞6時(shí),酶活力開始下降。故該菌產(chǎn)酶最適初始pH值為6。中性偏酸環(huán)境更適宜該菌株產(chǎn)蛋白酶,與文獻(xiàn)報(bào)道一致［24］。

圖7 培養(yǎng)基初始pH值對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶酶活的影響Fig.7 Effects of initial pH on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

2.2.4 培養(yǎng)溫度對菌株CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響

培養(yǎng)溫度對菌株CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響結(jié)果見圖8。由圖8可知,培養(yǎng)溫度對菌株CAUH83發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響較大。當(dāng)菌株在30℃培養(yǎng)時(shí),蛋白酶活性最高,達(dá)到1 862.2 U/mL。當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高時(shí),酶活力迅速下降,因此,選擇30℃作為發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度。

圖8 培養(yǎng)溫度對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶酶活的影響Fig.8 Effects of incubation temperature on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

郝林華等［26］研究粘質(zhì)沙雷氏菌的生長溫度時(shí)發(fā)現(xiàn),高溫對該菌的生長非常不利,在26～30℃時(shí)該菌生長效果最好,高于30℃時(shí)該菌的耐受性下降,產(chǎn)菌量也偏低。菌株CAUH83最適培養(yǎng)溫度為30℃,且培養(yǎng)溫度對該菌分泌蛋白酶的影響較為顯著。受溫度影響較大的還有假單胞菌Pseudomonas sp.W7,康傳紅等［27］在優(yōu)化該菌產(chǎn)低溫蛋白酶的發(fā)酵條件時(shí)發(fā)現(xiàn),在20℃時(shí)該酶蛋白酶活力達(dá)到最大值,繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度,酶活力逐漸下降,溫度升至30℃時(shí),酶活力僅為最大酶活力的15%。

2.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對菌株CAUH83產(chǎn)蛋白酶的影響

確定以上最適條件后,進(jìn)一步考察發(fā)酵時(shí)間對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響結(jié)果見圖9所示。由圖9可知,菌株CAUH83在優(yōu)化后的最適發(fā)酵條件下,12h已開始產(chǎn)酶,發(fā)酵48 h時(shí)酶活力達(dá)到最高水平,之后繼續(xù)延長培養(yǎng)時(shí)間,酶活力逐漸下降。因此,最佳培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

圖9 培養(yǎng)時(shí)間對粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83產(chǎn)蛋白酶酶活的影響Fig.9 Effects of incubation time on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

2.3 SDS-PAGE及酶譜分析

粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83在最適條件下培養(yǎng)48 h,其粗酶液的SDS-PAGE及蛋白酶酶譜如圖10所示。由圖10可知,菌株CAUH83分泌的主要蛋白分子質(zhì)量約為50 kDa。酶譜結(jié)果表明,該酶為蛋白酶。作為野生菌株,菌株CAUH83的發(fā)酵粗酶液中蛋白質(zhì)組分相對簡單,SDS-PAGE電泳條帶接近單一,這一特征有利于該酶的純化。

圖10 粘質(zhì)沙雷氏菌CAUH83發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖譜及酶譜圖Fig.10 SDS-PAGE electrophoretogram and zymogram of fermentation liquid from S.marcescens CAUH83

3 結(jié)論

本研究從海南土壤樣品中篩選得到一株高產(chǎn)蛋白酶的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化得到了該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)條件為：蔗糖添加量30%、大豆粉添加量30%、初始pH值6.0、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h。在此發(fā)酵條件下,蛋白酶的酶活力達(dá)到1 932.3 U/mL,較優(yōu)化之前提高了15.3倍,為目前已報(bào)道野生型粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)蛋白酶的最高水平。SDS-PAGE及酶譜分析表明,該菌所產(chǎn)的蛋白酶具有蛋白酶活性且蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約50 kDa。本研究通過研究高產(chǎn)蛋白酶菌株粘質(zhì)沙雷氏菌的發(fā)酵條件,為進(jìn)一步研究其產(chǎn)酶特性以及在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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