茅臺大曲中一株嗜熱放線菌的分離篩選及特性研究

王曉丹,羅小葉,邱樹毅*

(1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

茅臺大曲是一種高溫大曲,是通過傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的方法,在65℃條件下,用小麥加母曲經(jīng)過60 d的發(fā)酵自然形成的一個(gè)含有多種微生物體系的發(fā)酵制品［1-3］。由于多種微生物富集在大曲里且在制曲過程中自然生長起來,因此,整個(gè)大曲微生物復(fù)雜而多樣。目前,本課題組前期已經(jīng)采用純培養(yǎng)技術(shù)及分子生物學(xué)手段對茅臺大曲中的細(xì)菌、霉菌及酵母菌進(jìn)行了深入的研究,證實(shí)了茅臺大曲中細(xì)菌的生香動力、霉菌的糖化主力及酵母的酒醅發(fā)酵原動力的作用,詮釋了茅臺大曲中微生物在大曲酒的品質(zhì)及風(fēng)味呈現(xiàn)方面的重要作用［4-6］。

放線菌是大曲“菌系”中的一類具有較高鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的革蘭氏陽性細(xì)菌,其能產(chǎn)生豐富的活性次生代謝產(chǎn)物,是一種重要的微生物類群。在傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)領(lǐng)域有關(guān)放線菌的研究主要集中在白酒發(fā)酵過程中酒醅、大曲、窖泥、發(fā)酵池、曲房和窖房空氣中放線菌的分離及鑒定［7-9］,并對其釀造相關(guān)的放線菌揮發(fā)性物質(zhì)及代謝酶活性進(jìn)行了研究［10-11］。同時(shí),放線菌作為抗生素的主要生產(chǎn)菌株,在其他領(lǐng)域的研究較為深入；但作為白酒釀造的四大菌類之一,其某些獨(dú)特的代謝產(chǎn)物具有土味等特征,在白酒釀造過程中影響著酒體的風(fēng)味及風(fēng)格；然而,相對于其他三大類微生物,放線菌在白酒釀造過程中的作用還沒被引起足夠的重視［12］。目前,研究人員僅對茅臺大曲生產(chǎn)過程中周圍土壤及糟醅中的放線菌進(jìn)行了研究［13］,對茅臺大曲中放線菌的種類及功能鮮有研究報(bào)道。

本研究建立了一種有效的高溫放線菌分離篩選方法,通過形態(tài)學(xué)、生理生化及26SrDNA分子生物學(xué)對篩選的高溫放線菌進(jìn)行了鑒定,并采用大曲酶系酶活力測定方法對其酶活性質(zhì)及通過固態(tài)微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gaschromatography-massspectrometer,GC-MS)技術(shù)對發(fā)酵代謝產(chǎn)物成分進(jìn)行了分析,為了解放線菌在茅臺大曲中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

茅臺大曲來源于貴州茅臺酒股份有限公司的茅臺酒車間生產(chǎn)用高溫大曲,產(chǎn)地位于黔北遵義地區(qū)赤水河畔的茅臺鎮(zhèn)(東經(jīng)106°22′、北緯27°51′、海拔423m)。大曲樣品為已經(jīng)在車間貯存半年且準(zhǔn)備用于生產(chǎn)的已經(jīng)粉碎成20目的曲粉,在混合好的曲粉袋中按上、中、下層分別隨機(jī)取20個(gè)樣品,再經(jīng)過充分混合后,迅速放入無菌保鮮袋中,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 化學(xué)試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：美國BIOMIGA公司；萘啶酮酸、制霉菌素：上海源葉生物科技有限公司；新生霉素：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基(M1)、ISP2培養(yǎng)基(M2)、ISP3培養(yǎng)基(M3)、ISP4培養(yǎng)基(M4)、ISP5培養(yǎng)基(M5)、R2A培養(yǎng)基(M6)、淀粉-甘油培養(yǎng)基(M7)、GYM培養(yǎng)基(M8)、GTY培養(yǎng)基(M9)、HV培養(yǎng)基(M10)：實(shí)驗(yàn)室自制。

純化及菌種保藏培養(yǎng)基采用ISP2培養(yǎng)基：分別稱取酵母提取物4 g,麥芽提取物1 g,葡萄糖4 g及瓊脂15 g,用1 L蒸餾水溶解,然后用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH值為7.3,121℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、酵母膏4 g、蛋白胨4 g、酵母浸粉4 g、K2HPO44 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g,用1L蒸餾水溶解,然后用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH值為7.2～7.4,然后121℃滅菌20 min。

酶活力測定培養(yǎng)基采用麩皮培養(yǎng)基：稱取麩皮15 g,用15 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?然后121℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香培養(yǎng)基：將粉碎的高粱與未粉碎的高粱按質(zhì)量比為3∶1進(jìn)行混合,然后將混合的高粱與粉碎的小麥按質(zhì)量比為1∶1進(jìn)行混合,加入40%的水混合均勻,潤糧24 h后用瓶進(jìn)行分裝(50 g/瓶),用8層紗布進(jìn)行封口,121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

庫爾特BECKMAN離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特中國有限公司；Flex cycler多功能聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction,PCR)儀：德國耶拿分析儀器股份公司；DYCP44P電泳儀：北京欣惠澤奧科技有限公司；ZF25凝膠成像儀：上海方畦儀器有限公司；S3400N掃描電鏡：日本日立有限公司；FD-1C-80冷凍干燥機(jī)：上海喬躍電子有限公司；HP6890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選方法

(1)樣品預(yù)處理

干熱處理(A1)：用滅菌的燒杯稱取10g茅臺大曲樣品,然后將燒杯封口并置于100℃烘箱中加熱1 h；最后將大曲樣品放入含有90mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角瓶中,然后50℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min備用；濕熱處理(A2)：稱取10 g茅臺大曲樣品放入含有90 mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,將三角燒瓶置于50℃、200 r/min的恒溫水浴鍋中振蕩培養(yǎng)30min；先干熱后濕熱處理(A3)：經(jīng)干熱處理的茅臺大曲樣品懸浮液在50℃恒溫水浴鍋中熱處理10 min；CaCO3富集培養(yǎng)(A4)：按照大曲樣品與CaCO3質(zhì)量比為10∶1的比例在無菌燒杯中混合,添加適量無菌水,在濕度為30%、溫度為28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,然后放入含有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,將三角燒杯置于50℃、200 r/min的恒溫水浴鍋中振蕩培養(yǎng)30 min后備用；先CaCO3富集培養(yǎng)后再進(jìn)行濕熱處理(A5)。

(2)分離培養(yǎng)基的選擇

在45～60℃溫度下,比較5種預(yù)處理方法的樣品在10種分離培養(yǎng)基上的生長狀況。

(3)篩選溫度的設(shè)置

分離篩選溫度分別設(shè)置為45℃、50℃、55℃及60℃。

(4)稀釋液的篩選

分別選擇無菌生理鹽水(質(zhì)量濃度為9 g/L)及羧甲基纖維素鈉(carboxyl methyl cellulose-Na,CMC-Na)水溶液(質(zhì)量濃度為2.5 g/L)作為稀釋液［15］。

(5)抑制劑的添加

用0.1 mol/L NaOH溶液將萘啶酮酸配制成質(zhì)量濃度為50 mg/L(A1)、100 mg/L(A2)及150 mg/L(A3)的溶液；用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液將制霉菌素配制成質(zhì)量濃度為20mg/L(B1)、40mg/L(B2)及60mg/L(B3)的溶液；用無菌水將新生霉素配制成質(zhì)量濃度為30mg/L(C1)、40 mg/L(C2)及50 mg/L(C3)的溶液；用無菌水將重鉻酸鉀配制成質(zhì)量濃度為25 mg/L(D1)、50 mg/L(D2)及75 mg/L(D3)的溶液。同時(shí),抑制劑均用0.22μm的無菌濾膜過濾,然后加入到滅菌培養(yǎng)基中混勻,倒入培養(yǎng)皿中［16］。其中,抑制劑的添加組合如表1所示。

表1 抑制劑的添加組合Table 1 Adding combination of inhibitors

(6)分離涂布的方法

稱取10g茅臺大曲樣品加入到含有90mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,將三角燒杯置于28℃、200r/min的恒溫水浴鍋中振蕩培養(yǎng)30 min。然后取1 mL上述樣品懸浮液進(jìn)行10倍梯度稀釋,分別取0.2 mL各稀釋度菌懸液涂布于分離培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)基置于45℃、50℃、55℃及60℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),并進(jìn)行分離純化,分離得到的菌株用ISP2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng),并在4℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 菌種的鑒定

(1)形態(tài)培養(yǎng)特征觀察

菌株的培養(yǎng)特征觀察參照國際鏈霉菌計(jì)劃(international streptomyces project,ISP)中有關(guān)放線菌的培養(yǎng)特征進(jìn)行觀察［17］。

(2)掃描電鏡觀察

用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)48 h后,離心后棄上清,加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer solution,PBS)(分別稱取2.6g NaH2PO4·H2O及29 g Na2HPO4·12H2O,用500 mL蒸餾水溶解)洗滌菌體3次；向菌體沉淀中加入2.5%戊二醛固定液1.5 mL,4℃固定過夜；用30%、50%、70%、90%的叔丁醇/乙醇混合液進(jìn)行脫水,每次5 min,再用100%叔丁醇脫水2次,每次5 min；然后冷凍干燥4 h,干燥后的粉末樣品鍍金膜,用掃描電鏡進(jìn)行觀察［18-19］。

(3)生理生化特征鑒定

對放線菌進(jìn)行明膠液化實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、碳源利用實(shí)驗(yàn)、纖維素分解實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽實(shí)驗(yàn)及牛奶凝固與胨化實(shí)驗(yàn),并參照《鏈霉菌鑒定手冊》推薦的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和常用生理生化方法培養(yǎng)、觀察和記錄［14］。

(4)分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,以F(5‘-CCTACGGGAGGCAGCAG-3‘)及R(5‘-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3‘)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min,然后94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸9 min；取2μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA提取效果；PCR產(chǎn)物在上海立菲生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序；將測序數(shù)據(jù)在美國國家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索,用MEGA 5.05軟件進(jìn)行多序列比對,然后用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 放線菌粗酶液的制備及酶活力的測定

(1)粗酶液的制備

用接菌環(huán)取兩環(huán)活化的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,45℃培養(yǎng)2 d,然后以10%的接種量接種到麩皮培養(yǎng)基中,再45 ℃培養(yǎng)5 d,所得培養(yǎng)物與水按照1∶10(g∶mL)的比例混合攪勻,40℃水浴1 h,每隔15 min攪拌1次,最后進(jìn)行過濾,所得濾液為粗酶液。

(2)酶活力的測定

糖化型淀粉酶與纖維素酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法；酸性蛋白酶活力的測定根據(jù)商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中的方法進(jìn)行測定；脂肪酶活力的測定根據(jù)國標(biāo)GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的動態(tài)滴定法進(jìn)行測定；果膠酶活力的測定根據(jù)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 1502—1992《食品添加劑——果膠酶制劑》中的方法進(jìn)行測定。

糖化型淀粉酶酶活定義：在40℃、pH4.6條件下,1h水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖作為一個(gè)酶活力單位。纖維素酶酶活定義：50℃條件下,1 min催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位(U/g)。蛋白酶酶活定義：在40℃條件下1 min水解酪蛋白產(chǎn)生lμg酪氨酸,定義為1個(gè)蛋白酶活力單位(U/g)。脂肪酶酶活定義：1mL酶液在40℃,pH7.5條件下,1 min水解底物生成1μmol可滴定的脂肪酸為一個(gè)酶活力單位(U/g)。果膠酶酶活定義：1 mL酶液在50℃、pH3.5的條件下,1 h分解果膠產(chǎn)生l mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活單位(U/g)。

1.3.4 放線菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的香氣成分測定

放線菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的香氣成分測定采用氣質(zhì)聯(lián)用法。用接菌環(huán)取兩環(huán)活化的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,45℃培養(yǎng)2 d,以10%的接種量接入高粱與小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,再45℃培養(yǎng)7 d。均勻取樣品約10 g,置于50 mL固相微萃取儀采樣瓶中,插入手動進(jìn)樣器,在50℃左右萃取40min后取出,快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250℃)中,熱解吸3 min后進(jìn)樣。氣相色譜條件：色譜柱為Zebron ZB-5MSI彈性石英毛細(xì)管柱(30cm×0.25mm×0.25μm),柱溫為40℃,保留時(shí)間為2 min,以5℃/min升溫至270℃,運(yùn)行時(shí)間為48 min,汽化室溫度為250℃,載氣為高純He(99.999%),柱前壓為7.62 psi,載氣流量為1 mL/min,不分流進(jìn)樣,溶劑延遲時(shí)間為1 min。質(zhì)譜條件離子源為電子電離(electronic ionization,EI)源,離子源溫度為230℃,四極桿溫度為150℃,電子能量為70eV,發(fā)射電流為34.6μA,倍增器電壓為1 294 V；接口溫度為280℃,質(zhì)量范圍為20～450 amu。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對NIST2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖,確定揮發(fā)性化學(xué)成分,用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選條件的確定

在45～60℃條件下比較了5種預(yù)處理方法處理的樣品在10種分離培養(yǎng)基上的生長狀況,結(jié)果見表2。由表2可知,使用ISP2培養(yǎng)基(M2)、R2A培養(yǎng)基(M6)、GYM培養(yǎng)基(M8)及GTY培養(yǎng)基(M9)為分離培養(yǎng)基,樣品用A5預(yù)處理方法,羧甲基纖維素鈉(carboxyl methyl cellulose-Na,CMC-Na)作為稀釋劑,B1C1組合為抑制劑,在45℃及50℃溫度下,均能生長出具有細(xì)菌或放線菌形態(tài)特征的菌落。說明Ca2+對穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)和耐高溫都有重要作用,且濕熱處理能夠有效促進(jìn)嗜熱放線菌孢子的萌發(fā)［20］；同時(shí),由于羧甲基纖維素鈉水溶液具有較好的懸浮作用,并且其穩(wěn)定性好、無毒,在食品領(lǐng)域常被作為分散劑使用［21］,因此,在分離放線菌時(shí)羧甲基纖維素鈉是一種有效的稀釋劑。同時(shí),B1C1抑制劑組合的分離效果優(yōu)于萘啶酮酸和制霉菌素組合的分離效果。

表2 預(yù)處理方法的選擇Table 2 Selection of pretreatment methods

2.2 分離菌株的鑒定

從茅臺大曲中分離純化出1株具有放線菌菌落形態(tài)特征菌株,本實(shí)驗(yàn)室保藏編號為FBKL4.004。該菌的篩選方法：預(yù)處理方法為A5,稀釋劑為CMC-Na,分離培養(yǎng)基為GTY培養(yǎng)基,抑制劑為B1C1,培養(yǎng)溫度為45℃及50℃。對菌株FBKL4.004進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定。

(1)形態(tài)學(xué)特征

菌株FBKL4.004菌落形態(tài)及掃描電鏡結(jié)果見圖1。由圖1a可知,菌株FBKL4.004單菌落形狀為圓形,基內(nèi)菌絲為棕黃色,氣生菌絲為灰白色,菌落平坦、干燥致密,且無可溶性色素產(chǎn)生。由圖1b可知,通過掃描電鏡觀察FBKL4.004的特征,菌株FBKL4.004菌絲細(xì)長,有直鏈狀的孢子,孢子未分散,菌絲表面有附著物。

圖1 菌株FBKL4.004菌落形態(tài)(a)及掃描電鏡圖(b)Fig.1 Colonial morphology(a)and scanning electron microscope(b)of strain FBKL4.004

(2)生理生化特征

菌株FBKL4.004的生理生化試驗(yàn)包括明膠液化、淀粉水解、碳源利用、牛奶凝固與胨化、纖維素分解等,結(jié)果見表3。

表3 菌株FBKL4.004生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical properties of strain FBKL4.004

由表3可知,菌株FBKL4.004能利用碳源范圍較廣,葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、棉子糖等均能利用,能使淀粉水解和纖維素分解,明膠液化實(shí)驗(yàn)中使明膠凝固,使牛奶酶凝產(chǎn)酸。

(3)分子生物學(xué)鑒定

圖2 菌株FBKL4.004 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of strain FBKL4.004

圖3 菌株FBKL4.004的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain FBKL4.004 based on 16S rDNA gene sequence

以放線菌株FBKL4.004基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知,菌株FBKL4.004PCR擴(kuò)增結(jié)果在400bp處出現(xiàn)明顯條帶?；蛐蛄袦y定后,測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST),用MEGA5.05軟件進(jìn)行多序列比對,鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》、《鏈霉菌鑒定手冊》,結(jié)合菌株FBKL4.004形態(tài)、生理生化特征及分子生物學(xué)比對分析,菌株FBKL4.004與Streptomyces bangladeshensis(NR043164)聚為一類,其同源性為98%,因此將菌株FBKL4.004鑒定為Streptomyces bangladeshensis。該菌于2005年首次從孟加拉國納托爾的土壤中分離到,被歸類到鏈霉菌屬的一個(gè)新物種,其16SrRNA比對分析與嗜熱鏈霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)有較高的同源性［22］,對革蘭氏陽性菌及某些致病真菌有抗菌活性［23-24］,具有生物降解聚(β-羥基丁酸酯)的作用［25］。

2.3 放線菌的產(chǎn)酶特性

醬香大曲的酶系主要有液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、單寧酶、果膠酶、酯化酶及漆酶等酶類。本研究對嗜熱放線菌(Streptomycesbangladeshensis)FBKL4.004在釀造過程中產(chǎn)生的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、糖化酶及纖維素酶的活性進(jìn)行了研究,結(jié)果見表4。由表4可知,各種酶的酶活力差異較大,其中酸性蛋白酶和纖維素酶的酶活比較低,分別為3.34 U/g、2.07 U/g,產(chǎn)糖化酶及果膠酶活力最高,分別為345.03 U/g及318.57 U/g。

表4 菌株FBKL4.004酶活力測定結(jié)果Table 4 Determination results of enzyme activity from strain FBKL4.004

2.4 放線菌固態(tài)發(fā)酵香氣成分分析

圖4 菌株FBKL4.004固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ions chromatogram of volatile compounds of strain FBKL4.004 solid-state fermentation

對從茅臺大曲中分離得到的嗜熱放線菌株FBKL4.004進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵,并通過固態(tài)微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其揮發(fā)性成分組成及風(fēng)味成分進(jìn)行了測定,總離子流色譜圖結(jié)果見圖4,各香氣成分鑒定結(jié)果見表5。

表5 菌株FBKL4.004固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分組成分析結(jié)果Table 5 Analysis results of volatile components in strain FBKL4.004 solid-state fermentation products

由表5可知,嗜熱放線菌FBKL4.004固態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物種類豐富,主要以酯類物質(zhì)為主(34.57%),包括肉豆蔻酸甲酯、十二酸甲酯及14-甲基-十五烷酸甲酯等,其次是萜烯類物質(zhì)(18.51%)及吡嗪類(17.63%)。

3 結(jié)論

本研究建立了一種有效的分離放線菌的方法,并從茅臺大曲中分離篩選出了1株嗜熱放線菌(Streptomyces bangladeshensis)FBKL4.004。通過對其酶活和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)糖化酶和果膠酶的能力較為突出,分別為345.03 U/g及318.57 U/g；同時(shí),通過對其固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)含量最高(34.57%),其次為萜烯類物質(zhì)(18.51%)及吡嗪類物質(zhì)(17.63%)。本研究為發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵中更多的微生物資源及其在白酒發(fā)酵生產(chǎn)中的作用及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社,2013：762-784.

［2］陳 筆.醬香型白酒釀造過程中霉菌群落結(jié)構(gòu)以及霉菌與酵母相互作用的研究［D］.無錫：江南大學(xué),2014.

［3］徐超英,賴世強(qiáng),徐厚祿,等.醬香型白酒糟醅中耐高溫酵母菌的特性研究［J］.釀酒科技,2012(8)：38-40.

［4］班世棟,王曉丹,陳孟強(qiáng),等.醬香型大曲中具產(chǎn)酶功能霉菌的分離篩選［J］.釀酒,2014,41(4)：31-36.

［5］王曉丹,陳美竹,班世棟,等.茅臺大曲中酵母的分離、鑒定及其功能初探［J］.食品科學(xué),2017,38(4),51-57.

［6］王曉丹,徐 佳,周鴻翔,等.醬香型大曲中分離到的阿姆斯特丹散囊菌產(chǎn)酶產(chǎn)香特性［J］.食品科學(xué),2016,37(11)：154-159.

［7］崔福來,王振羽,王風(fēng)俠,等.酒醅及大曲微生物分離報(bào)告［J］.微生物學(xué)雜志,1981(2)：13-19.

［8］李佑紅,吳衍庸.四川濃香型與醬香型酒曲細(xì)菌區(qū)系構(gòu)成的比較研究［J］.微生物學(xué)通報(bào),1992,19(4)：42-44.

［9］張肖克,黃永光.窖泥糟醅發(fā)酵過程微生物多態(tài)性特征［J］.釀酒科技,2006(1)：65-72.

［10］王 濤,游 玲.濃香型白酒釀造相關(guān)放線菌揮發(fā)性產(chǎn)物分析［J］.食品科學(xué),2012,33(4)：184-185.

［11］游 玲,王 濤.4株濃香型白酒釀造相關(guān)鏈霉菌的揮發(fā)性產(chǎn)物研究［J］.食品工業(yè),2008(4)：35-37.

［12］尤小龍,黃蘊(yùn)莉,黃永光,等.放線菌對發(fā)酵過程產(chǎn)醬香功能菌的生物學(xué)特性研究［J］.釀酒科技,2015(8)：1-6.

［13］張 敬,何偉宏,唐蜀昆,等.云南干熱環(huán)境可培養(yǎng)高溫放線菌多樣性及產(chǎn)纖維素酶活性評價(jià)［J］.微生物學(xué)通報(bào),2013,40(6)：1109-1120.

［14］東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社,2001：353-398.

［15］段淑蓉.幾種培養(yǎng)基選擇性分離稀有放線菌的方法［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,15(21)：47-49.

［16］司美茹,薛泉宏,來航線.放線菌分離培養(yǎng)基篩選及雜菌抑制方法研究［J］.微生物學(xué)通報(bào),2004,31(2)：61-65.

［17］譚 力,袁 博,秦 盛,等.邳州銀杏內(nèi)生放線菌分離、篩選及活性菌株鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào),2015,42(6)：1043-1051.

［18］黃大林,徐雅娟,袁桂峰,等.放線菌掃描電鏡樣品簡便快速的制備方法［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(17)：8849-8850.

［19］楊 瑞,王 歧,張 露,等.放線菌掃描電鏡樣品制備方法比較研究［J］.電子顯微學(xué)報(bào),2014,33(1)：84-89.

［20］劉志恒,姜成林.放線菌現(xiàn)代生物學(xué)與生物技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社,2004：218-221.

［21］汪學(xué)榮,王健全,鄧尚貴.羧甲基纖維素鈉在食品工業(yè)中應(yīng)用及研究現(xiàn)狀［J］.糧食與油脂,2006(3)：42-45.

［22］AL-BARI M A A,BHUIYAN M S A,FLORES M E,et al.Streptomyces bangladeshensis sp.nov.,isolated from soil,which produces bis-(2-ethylhexyl)phthalate［J］.Int J Syst Evol Micr,2005,55：1973-1977.

［23］AL-BARIM A A,SAYEED M A,RAHMAN M S,et al.Characterization and antimicrobial activities of a phlhalic acid derivative produced by Streptomyces bangladeshiensis：A novel species in Bangladesh ［J］.Res J Med Med Sci,2006,1(2)：77-81.

［24］CHAIRMAN K,RANJIT SINGH A JA,ALAGUMUTHU G.Cytotoxic and antioxidantactivity of selected marinesponges［J］.Asian Pac J Trop Dis,2012,2(3)：234-238.

［25］HSU K J,TSENG M,DON T M,et al.Biodegradation of poly(β-hydroxybutyrate)by anovel isolateof Streptomycesbangladeshensis77T-4［J］.Bot Stud,2012,53(3)：307-313.