不同有機氮源對葡萄酒發(fā)酵的影響

謝詩怡,韓 月,張 燁,孫玉梅*

(大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧 大連 116034)

隨著葡萄酒消費量的增加,對葡萄酒品質(zhì)的要求也越來越高。葡萄酒品質(zhì)與釀酒葡萄原料和釀造工藝密切相關(guān)［1］。酵母可同化氮(yeast assimilablenitrogen,YAN)即能被酵母利用的氮源,主要是除脯氨酸外的α-氨基酸、小分子多肽和銨態(tài)氮這三類氮源［2］。葡萄原料的可同化氮含量直接影響酵母菌的生長和代謝,從而影響葡萄酒的發(fā)酵過程和最終產(chǎn)品質(zhì)量。當釀酒葡萄中可同化氮含量過低時,會影響發(fā)酵速度并產(chǎn)生有刺激性的二氧化硫氣體影響酒的品質(zhì)［3］。為保證氮源不足的葡萄原料正常發(fā)酵,常添加無機氮源如磷酸氫二銨,或添加氨基酸。添加銨鹽或單一氨基酸會導致酵母利用更多的糖合成氨基酸,使乙醇轉(zhuǎn)化率下降,同時影響葡萄酒中有機酸生成［4］。使用混合氨基酸作為補加氮源能保證葡萄酒發(fā)酵的進程和品質(zhì)［5］。酵母浸粉含有大量的氨基酸、肽、小分子蛋白、核苷酸、糖、維生素和風味化合物,常用作抗生素、氨基酸、有機酸、酶制劑等發(fā)酵生產(chǎn)的氮源［6］,也有用作酸奶發(fā)酵氮源的探討［7］。在葡萄酒氮源補充方面,目前主要選用無機氮源和氨基酸,對混合氨基酸作氮源的研究僅測定了糖、甘油、乙醇、乙酸等呈味物質(zhì),并未測定高級醇產(chǎn)量［8-10］。而且,尚無酵母浸粉的應用先例。為了探究酵母浸粉是否適合作為葡萄酒發(fā)酵的補加氮源,本研究分別以相同可同化氮含量的酵母浸粉和混合氨基酸作為模擬葡萄汁唯一氮源,進行葡萄酒發(fā)酵,從發(fā)酵過程中的二氧化碳生成量以及還原糖、可同化氮、甘油和揮發(fā)性化合物含量,對比兩種氮源對葡萄酒發(fā)酵過程和葡萄酒品質(zhì)的影響,以探究酵母浸粉作為葡萄酒發(fā)酵氮源不足時補加氮源的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

商業(yè)酵母ST：法國LAFFORT公司；717型陰離子交換樹脂：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、果糖：山東西王藥業(yè)有限公司；酵母浸粉(生化試劑)：北京奧博星生物試劑有限公司；各種氨基酸、乙醛：上海阿拉丁生化科技有限公司。乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；乙酸：天津市恒興化學試劑有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇：天津市科密歐化學試劑有限公司；異戊醇：天津市光復科技發(fā)展有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC6850氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；722S可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TELTA320 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；CR21GⅢ離心機：日立工機株式會社。

1.3 方法

1.3.1 酵母馴化

為了適應葡萄酒發(fā)酵的高糖低溫環(huán)境,需對活性干酵母進行逐級馴化,再將種子液接種到發(fā)酵液中。本實驗涉及的活性干酵母馴化步驟如下：稱取1 g活性干酵母加入10 mL無菌水中進行溶解,在38℃條件下恒溫培養(yǎng)15 min,每5min輕微攪動一次。隨后加入10mL稀釋2倍的模擬葡萄汁,在25℃條件下恒溫培養(yǎng)1 h,每30 min攪動一次。最后加入20 mL模擬葡萄汁,20℃條件下恒溫培養(yǎng)2 h,每30 min攪動一次。得到酵母種子液。

1.3.2 模擬汁成分

葡萄糖180 g/L、果糖180 g/L、檸檬酸0.5 g/L、蘋果酸5 g/L、酒石酸5 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、無水硫酸鎂0.5 g/L。

氮源：兩組分別添加酵母浸粉和混合氨基酸作為唯一氮源,氮源添加量為180mg/L酵母可同化氮(YAN)。此含量為普通葡萄汁中平均有機氮源含量。即分別添加酵母浸粉3.9 g/L,混合氨基酸(180 mg/L)［11］,組成詳見表1。

表1 混合氨基酸成分及可同化氮含量Table 1 Composition and assimilable nitrogen contents of mixed amino acids

1.3.3 葡萄酒發(fā)酵

每瓶接入馴化后的種子液12 mL,于18℃條件下控溫發(fā)酵。發(fā)酵體系為1 L玻璃瓶：瓶高35 cm,直徑7.6 cm,瓶口外徑2.5 cm,瓶徑長6 cm。

在1 L酒瓶中裝500 mL模擬汁,每瓶接入馴化后的種子液12 mL,于18℃條件下控溫發(fā)酵。發(fā)酵前2 d用棉塞封瓶口,當發(fā)酵液中有氣體產(chǎn)生時,把棉塞換為發(fā)酵栓,進行厭氧發(fā)酵。

1.3.4 取樣及樣品預處理

發(fā)酵過程中前期(0～10 d)每3天取樣一次,中期(10～20 d)和后期(20～30 d)每5 d取樣一次,取樣量為35 mL。發(fā)酵液于4℃,10 000 r/min離心10 min得發(fā)酵上清液,將其保存于-20℃冰箱中,待測定。測定各理化指標時,于4℃冰箱中解凍。

1.3.5 分析檢測

二氧化碳生成量測定：采用發(fā)酵體系失重測量法。充分晃動裝有發(fā)酵栓的玻璃瓶,使發(fā)酵液充分混勻且其中溶解的二氧化碳完全溢出,然后采用電子天平進行測量［12］。

還原糖含量測定：將發(fā)酵上清液用去離子水稀釋至適當濃度,用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法測定還原糖含量［13］。

甘油含量測定：采用高碘酸氧化法［14］。步驟：①處理樹脂。用1 mol/L NaOH和HCl按照堿-酸-堿的順序?qū)?01×7型強堿陰離子交換樹脂進行洗脫。洗脫時用樹脂體積的3～5倍的1 mol/L NaOH或HCl洗脫1 h,最后用去離子水洗至中性并用17g/L的AgNO3檢測是否有氯離子存在,如有則繼續(xù)用去離子水洗至無氯離子后備用。②裝柱。取洗脫后的樹脂,填裝到長20 mL,內(nèi)徑1 cm的玻璃柱中,調(diào)整液面高于樹脂表面0.5 cm左右。③上樣。取2 mL發(fā)酵上清液加入到玻璃柱中。④收集洗脫液。上樣后開始收集洗脫液,控制流速為2 mL/min左右。洗脫時,加入無二氧化碳去離子水保持液面距樹脂表面0.5 cm左右,每管收集洗脫液2 mL。⑤洗脫液檢測。每管洗脫液中取0.2 mL進行還原糖檢測,直至洗脫液中出現(xiàn)還原糖為止。

可同化氮含量測定：采用甲醛值法［15］。量取50 mL甲醛溶液于100 mL燒杯中,置于磁力攪拌器上,將pH電極放到燒杯中合適的位置,邊攪拌邊用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整甲醛溶液pH 8.5,備用。在5mL發(fā)酵上清液中加45mL去離子水和3滴30%過氧化氫。在磁力攪拌下,用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整上述混合液的pH值為8.5。然后加入2 mL pH 8.5的甲醛溶液,反應3 min,用0.01 mol/L標準NaOH溶液滴定至pH 8.5。記錄消耗0.01 mol/L標準NaOH溶液的體積。樣品中可同化氮含量計算公式如下：

M=14×C×V×1 000/5

式中：M為樣品中可同化氮含量,mg/L；C為標準NaOH溶液濃度,mol/L；V為0.01 mol/L標準NaOH溶液消耗體積,mL；14為氮的毫克當量；5為樣品體積,mL；1 000為換算系數(shù)。

揮發(fā)性化合物的測定采用氣相色譜法。樣品前處理：準確移取7mL發(fā)酵上清液于頂空氣相瓶中,加入1.4g NaCl固體和磁力攪拌轉(zhuǎn)子,壓蓋器密封頂空瓶蓋,放在磁力攪拌器(350 r/min、45 min)上使NaCl充分溶解,放置于進樣槽。靜態(tài)頂空氣相色譜(headspacegaschromatography,HS-GC)條件：安捷倫7697A頂空進樣器,Agilent DB-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),檢測器是氫火焰檢測器(flame ionization detector,FID),空氣流量300 mL/min,氫氣流量30 mL/min,載氣(氮氣)流量10 mL/min。分流進樣：分流比是10∶1；進樣量2μL；樣品平衡溫度90℃；樣品平衡時間30 min；進樣口溫度250℃,檢測器溫度250℃。升溫程序：初始溫度40℃,保持10 min,然后以5℃/min升至190℃,保持1 min,接著以20℃/min升至230℃,保持2 min。

定性定量方法：選擇含量較高和影響較大的7種揮發(fā)性化合物(乙醇、乙酸、乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇)標準品,在上述色譜條件下進行分析,以各種揮發(fā)性化合物的色譜出峰時間作為樣品組分的定性依據(jù)。將處理好的樣品按上述色譜條件進行分析,以各揮發(fā)性化合物的色譜峰面積進行定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

本研究的不同氮源發(fā)酵均采取兩組平行,所有理化指標均為3個平行測定,實驗結(jié)果為平行實驗的平均值。實驗數(shù)據(jù)均用SPSS24進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源的葡萄酒發(fā)酵二氧化碳生成量

在葡萄酒發(fā)酵過程中,伴隨著二氧化碳的生成和排放,發(fā)酵體系的質(zhì)量減少。因此,發(fā)酵系統(tǒng)減少的質(zhì)量即二氧化碳生成量。通常用二氧化碳生成量衡量發(fā)酵狀態(tài)。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵二氧化碳生成量結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄酒發(fā)酵過程中二氧化碳生成量的變化Fig.1 Changes of carbon dioxide production during wine fermentation process

由圖1可知,酵母浸粉組和混合氨基酸組均從第3天開始生成二氧化碳,發(fā)酵前20 d二氧化碳積累較快,累積生成量分別為92.4 g/L和38.6g/L,后15d的兩組二氧化碳生成量變化較小,僅增加14.6 g/L和13.0 g/L,可能因為在此前還原糖被大量消耗并生成大量乙醇,抑制了酵母活性。在整個發(fā)酵過程中,酵母浸粉組的二氧化碳生成量一直大于混合氨基酸組(P＜0.05),兩組后15 d的二氧化碳生成量差值始終在53.8～55.4 g/L。在JOLLY N P等［15］的研究中,二氧化碳生成量的變化規(guī)律與本研究相似,其發(fā)酵狀態(tài)轉(zhuǎn)變時間為發(fā)酵第7天,這種差異可能是由于發(fā)酵初始糖濃度不同而造成的。

酵母浸粉不但富含各種氨基酸,還含有維生素及無機鹽等微量物質(zhì)［7］,這些微量物質(zhì)可能在一定程度上對酵母的生長代謝起到促進作用。上述結(jié)果表明,與混合氨基酸氮源相比,酵母浸粉氮源雖不能縮短啟酵時間和發(fā)酵狀態(tài)轉(zhuǎn)變時間,但可以加快發(fā)酵速度。

2.2 不同氮源的葡萄酒發(fā)酵還原糖含量

還原糖作為葡萄酒發(fā)酵的能源和碳源,在發(fā)酵過程中逐漸被消耗,常用其含量變化衡量發(fā)酵進度。還原糖剩余量也影響最終葡萄酒的品質(zhì)。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵過程中還原糖含量變化結(jié)果見圖2。

圖2 葡萄酒發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.2 Changes of reducing sugar contents during wine fermentation process

由圖2可知,酵母浸粉組降糖速度始終快于混合氨基酸組。酵母浸粉組在5～16 d時發(fā)酵迅速,而混合氨基酸組則為12～16 d。從整體上看,酵母浸粉組比混合氨基酸組發(fā)酵速度快,耗糖量大(P＜0.05),兩組最終還原糖消耗量分別為295.70 g/L和165.24 g/L。產(chǎn)生這種差異是因為酵母浸粉所含的維生素等物質(zhì)對酵母生長代謝具有促進作用。這一結(jié)果與二氧化碳生成量變化規(guī)律相一致,與混合氨基酸相比,酵母浸粉具有加快發(fā)酵速度的特點。

2.3 不同氮源的葡萄酒發(fā)酵甘油含量

甘油無揮發(fā)性、無氣味,不影響葡萄酒香氣；具有甜味、黏性,有利于提高葡萄酒的質(zhì)量。提高甘油含量會增加葡萄酒的甜味和黏度［16］。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵甘油含量變化結(jié)果見圖3。

圖3 葡萄酒發(fā)酵過程中甘油含量的變化Fig.3 Changes of glycerol contents during wine fermentation process

由圖3可知,在發(fā)酵過程中,氨基酸組平穩(wěn)持續(xù)積累甘油。酵母浸粉組在發(fā)酵前15 d甘油生成量較大,15～19 d趨于平穩(wěn),在發(fā)酵19 d達到最大值28.08 g/L,之后略降低至26.50 g/L。酵母菌在高濃度糖酒精發(fā)酵時產(chǎn)甘油以抵抗高糖帶來的高滲透壓以及在較高的乙醇濃度下保持酵母活性［17］,生成的甘油可能用于合成其他物質(zhì)而使后期甘油含量降低。氨基酸組的甘油生成量始終小于同期酵母浸粉組的甘油生成量,最終兩組甘油含量分別為18.55 g/L和26.50g/L,差異顯著(P＜0.05)。本研究結(jié)果與PIGEAUGM等［18-19］的研究結(jié)果一致。

2.4 不同氮源的葡萄酒發(fā)酵可同化氮含量

可同化氮含量會影響發(fā)酵過程中酵母的生長和代謝,影響乙醇、甘油、酯類、乙酸、高級醇、乙醛和H2S等含量［4］。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵可同化氮含量變化結(jié)果見圖4。

圖4 葡萄酒發(fā)酵過程中可同化氮含量的變化Fig.4 Changes of assimilable nitrogen contents during wine fermentation process

由圖4可知,酵母浸粉組和氨基酸組的可同化氮變化趨勢大致相同,均在發(fā)酵9～14 d間有小幅度增加,漲幅分別為2.48 mg/L和15.85 mg/L,這一現(xiàn)象可能是發(fā)酵液中酵母自溶釋放出內(nèi)容物所致。過高的可同化氮含量可能促進腐敗微生物生長,增加葡萄酒中氨基甲酸乙酯和生物胺含量,增加葡萄酒的毒性,影響葡萄酒的品質(zhì)［4］。兩種實驗氮源的葡萄酒發(fā)酵可同化氮消耗分別為89.41mg/L和84.17mg/L,沒有明顯差異(P＞0.05)。結(jié)果表明,酵母浸粉作為氮源并不影響酵母對發(fā)酵液中可同化氮的利用。

2.5 不同氮源的葡萄酒發(fā)酵風味物質(zhì)含量

2.5.1 乙醇含量

YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙醇含量變化結(jié)果見圖5。

圖5 葡萄酒發(fā)酵過程中乙醇含量的變化Fig.5 Changes of ethanol contents during wine fermentation process

由圖5可知,兩組乙醇生成速度均為先快后慢。乙醇積累量過大,抑制酵母活性,導致生成速度減慢。酵母浸粉組在整個發(fā)酵過程中乙醇生成速度一直高于混合氨基酸組,最終兩組乙醇含量差異顯著(P＜0.05),分別為97.20 g/L和51.05 g/L。這種差異是由酵母浸粉對酵母生長代謝的促進作用導致的。乙醇是酵母無氧發(fā)酵的重要產(chǎn)物,其生成量隨耗糖量增加而增加,這也與PIGEAU GM等［18-19］的研究結(jié)果一致。結(jié)果表明,與混合氨基酸相比,酵母浸粉做氮源可以更快更多的生成乙醇,減少發(fā)酵時間。

2.5.2 乙酸含量

乙酸是酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物,由酵母的異常代謝生成。由于其具有特殊氣味和口味,因此在葡萄酒中應控制乙酸含量,一般不宜超過1.2 g/L［20］。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙酸含量變化結(jié)果見圖6。

圖6 葡萄酒發(fā)酵過程中乙酸含量的變化Fig.6 Changes of acetic acid contents during wine fermentation process

由圖6可知,酵母浸粉組和氨基酸組乙酸含量均持續(xù)增加,16 d后乙酸生成速度減小。第5天時兩組乙酸含量分別為0.29 g/L和0.11 g/L,差異顯著(P＜0.05),說明酵母浸粉組比混合氨基酸組更早的開始生成乙酸。在整個發(fā)酵過程中,酵母浸粉組乙酸含量一直高于混合氨基酸組,最終兩組乙酸含量分別為1.08g/L和0.54g/L,差異顯著(P＜0.05)。兩組乙酸含量隨還原糖消耗量增而增加。研究表明,當初始還原糖含量為350～400 g/L時,乙酸含量與耗糖量正相關(guān)［19］,這與本研究結(jié)果一致。結(jié)果表明,與混合氨基酸相比,酵母浸粉作為氮源生成乙酸用時更短且生成量更大。

2.5.3 乙醛含量

乙醛是酒精發(fā)酵過程中通過丙酮酸脫羧形成,隨后被還原成乙醇。含量過高(≥80 mg/L)會影響葡萄酒的品質(zhì)［12］。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙醛含量變化結(jié)果見圖7。

圖7 葡萄酒發(fā)酵過程中乙醛含量的變化Fig.7 Changes of acetaldehyde contents during wine fermentation

由圖7可知,酵母浸粉組在發(fā)酵第5天時乙醛含量達到最大值11.01 mg/L,之后乙醛含量開始下降,第19天時下降為3.78 mg/L,在發(fā)酵后期有小幅回升,增加至4.50 mg/L?；旌习被峤M則在第16天之間達到最大值6.65 mg/L,第16天后直至發(fā)酵結(jié)束持續(xù)下降至4.63 g/L。發(fā)酵結(jié)束時兩組乙醛含量無顯著差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明,與混合氨基酸相比,酵母浸粉更早更快的生成和消耗乙醛,若縮短發(fā)酵時間,則酵母浸粉組會產(chǎn)生比混合氨基酸更少的乙醛。

2.5.4 乙酸乙酯含量

乙酸乙酯具有甜味和果香味,濃度過高時有刺激性氣味,因此葡萄酒中乙酸乙酯含量不宜過高［16］。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙酸乙酯含量變化結(jié)果見圖8。

由圖8可知,酵母浸粉組和混合氨基酸組乙酸乙酯含量變化趨勢基本相同。在發(fā)酵各個時期酵母浸粉組乙酸乙酯含量始終高于混合氨基酸組,最終兩組乙酸乙酯含量分別為46.05 mg/L和32.35 mg/L,差異顯著(P＜0.05)。由于發(fā)酵過程中的乙酸乙酯是由乙酸和乙醇合成［21］,因此乙酸乙酯含量與乙酸含量變化趨勢相似。

圖8 葡萄酒發(fā)酵過程中乙酸乙酯含量的變化Fig.8 Changes of ethyl acetate contents during wine fermentation

2.5.5 高級醇含量

高級醇是酵母菌異常代謝的產(chǎn)物,普遍具有刺激性,含量在250～350 mg/L為宜,含量過高(≥550 mg/L)時易使飲用者有“上頭”感［22］。YAN為180 mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵高級醇含量變化結(jié)果見圖9。

圖9 葡萄酒發(fā)酵過程中高級醇含量的變化Fig.9 Changes of higher alcohol contents during wine fermentation process

由圖9可知,發(fā)酵前5 d兩組均沒有高級醇生成。兩組高級醇生成規(guī)律相似,酵母浸粉組生成更多正丙醇和異戊醇,混合氨基酸組生成更多異丁醇。這種差異可能是由于兩種氮源氨基酸組成含量不同導致。由于正丙醇、異丁醇和異戊醇為葡萄酒發(fā)酵過程中生成量最大的3種高級醇［23］,故葡萄酒發(fā)酵的高級醇生成總量可用這三種高級醇生成量的總和表示。最終酵母浸粉組高級醇總生成量(203.78 mg/L)略大于混合氨基酸組(184.32mg/L),無顯著差異(P＞0.05)。

3 結(jié)論

本研究分別采用酵母浸粉和混合氨基酸為模擬葡萄汁發(fā)酵的可同化氮源,在可同化氮供應量均為180mg/L的情況下,兩組的可同化氮消耗量也基本相同,分別為89.41 mg/L和84.17mg/L。兩組各生成物含量都在國標允許范圍內(nèi)［15,24］,與混合氨基酸相比,使用酵母浸粉還原糖消耗量增加130.47 g/L,增加乙醇46.14 g/L、甘油7.95 g/L、乙酸0.54 g/L,增幅分別為78.95%、90.38%、42.84%和99.35%。兩組乙酸乙酯和高級醇生成量無明顯差異(P＞0.05)?？梢?酵母浸粉作氮源不同程度地促進了模擬葡萄汁發(fā)酵中還原糖的消耗和各種物質(zhì)的生成。由此可以證明,酵母浸粉可以作為葡萄酒發(fā)酵的氮源補充,添加少量酵母浸粉有利于加快發(fā)酵速度,但若大量添加酵母浸粉可能會導致葡萄酒品質(zhì)的降低。

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