枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的研究進展

張曉燕,國立東,劉曉艷*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一類革蘭氏陽性、好氧型細菌,具有單層的細胞外膜,細胞壁不含內(nèi)毒素,菌體呈污白色或微黃色,表面粗糙能夠形成孢子,無莢膜,周生鞭毛,能運動?？莶菅挎邨U菌在自然界分布廣泛,已有研究報道在食品［1］、土壤［2］、海洋［3］、植物［4］及動物腸道［5］等環(huán)境中分離到枯草芽孢桿菌,因?qū)Νh(huán)境適應(yīng)性強、發(fā)酵工藝簡單、對人畜無毒無害,成本低、環(huán)保等特點,先后被美國食品藥品監(jiān)督管理局和我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定為安全菌種,廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、酶制劑等工業(yè)生產(chǎn)。枯草芽孢桿菌屬于益生菌,具有改善動物消化道微生物群結(jié)構(gòu)、提高免疫力、促進生長發(fā)育、提高生產(chǎn)性能的生理學(xué)功能［6-7］,并且對植物生長也具有促進作用［8］。在醫(yī)藥領(lǐng)域,枯草芽孢桿菌可改善脂代謝平衡、緩解氧化壓力［9］,可用于發(fā)酵中藥藥渣促進其生物活性成分的釋放,為中藥藥渣的高值化利用提供新途徑［10］。此外,枯草芽孢桿菌因其高蛋白酶活性而廣泛用于改善飼料品質(zhì)［11-12］。據(jù)不完全統(tǒng)計,來源于枯草芽孢桿菌的酶制劑占整個酶市場的50%［13］,其中應(yīng)用最廣泛的是蛋白酶,蛋白酶根據(jù)最適pH值不同分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。其中,中性蛋白酶最早用于工業(yè)生產(chǎn),其作為一種工業(yè)酶制劑使用時,與化學(xué)試劑相比具有作用條件溫和、催化反應(yīng)速度快、無工業(yè)污染等優(yōu)點。本文著重對枯草芽孢桿菌所產(chǎn)中性蛋白酶的相關(guān)研究進行簡要綜述,以期為其深入研究提供參考。

1 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的特性

中性蛋白酶是能夠在中性以及弱酸或弱堿條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解成小分子肽的一類蛋白酶,其最適作用pH值為6.0～7.5?？莶菅挎邨U菌中性蛋白酶按活性中心劃分屬于金屬蛋白酶,其酶活性大都依賴于某種二價金屬陽離子(如Zn2+、Ca2+、Mg2+等),這些金屬離子對酶起激活或保護作用,而某些非依賴性陽離子會抑制酶活性［14］,金屬螯合劑乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetieacid,EDTA)、乙醇、異丙醇等化學(xué)試劑也會抑制酶活性?？莶菅挎邨U菌中性蛋白酶的酶活、性質(zhì)和產(chǎn)量主要受其菌種來源、菌種選育以及發(fā)酵培養(yǎng)條件等因素的影響。不同來源的枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力不同,所產(chǎn)中性蛋白酶在穩(wěn)定性、耐熱性、耐受性以及對蛋白質(zhì)的水解能力等方面也存在差異。此外,枯草芽孢桿菌中性蛋白酶在酶促反應(yīng)中的活性還會受到作用環(huán)境酸堿度和溫度的影響［15-16］。如枯草芽孢桿菌1398中性蛋白酶在pH 7～8之間均具有活性,且在環(huán)境pH值為7.6時酶活性最大,并且在一定范圍內(nèi)酶活性會隨著溫度的升高而增大,當達到某一臨界值時酶活性最高,之后繼續(xù)升高溫度酶活性急劇降低［17］?？莶菅挎邨U菌不同代表菌株的中性蛋白酶特性如表1所示。

表1 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的特性Table 1 Characteristics of neutral protease from B.subtilis

2 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶制劑為一種天然生物制劑,與化學(xué)添加劑相比,其對人和動物更加安全可行。其主要應(yīng)用在如下行業(yè)中。

2.1 食品行業(yè)中的應(yīng)用

可用于肉類鮮化、啤酒釀造、果汁、烤焙等食品工業(yè),從而改善食品的味道、品質(zhì)、穩(wěn)定性和安全性［14］。由于中性蛋白酶可以水解蛋白質(zhì),所以常被應(yīng)用于啤酒和各種茶類飲品的澄清,也能夠水解肌原纖維和彈性蛋白使肉類得到鮮化,在烘焙食品時加入枯草芽孢桿菌中性蛋白酶可提升面團的柔韌性和延伸性。

2.2 飼料行業(yè)中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌具有增強動物免疫功能、拮抗致病微生物等作用,是經(jīng)我國農(nóng)業(yè)部認定的2種飼料添加菌種之一。中性蛋白酶可用于動物飼料的生產(chǎn),減少飼料中抗營養(yǎng)因子的不良影響,促進動物消化道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收進而有助于動物生長［22］。

2.3 醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用

近年來,中性蛋白酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用也逐漸增多,主要利用其消炎、抗腫脹、利膽、止痛助消化的功效,其消炎止痛作用比一般的抗生素和鎮(zhèn)痛劑更強［23］。在皮膚病治療和化妝品研發(fā)中應(yīng)用中性蛋白酶能夠加強皮膚新陳代謝,去除老化角質(zhì)、減少青春痘形成［24］。在臨床通過胰島移植治療I型糖尿病過程中,將中性蛋白酶與另外兩種膠原酶共同作用,能夠促進于人體胰島與胰腺的分離［25-26］。另外,中性蛋白酶的固定化可應(yīng)用于制備抗癌制劑的中間體［27］。目前,利用蛋白酶水解動物蛋白制備生物肽的研究也較為活躍,研究人員采用中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白［28］和鮐魚多肽［29］成功制備了抗氧化肽,結(jié)果顯示中性蛋白酶為最佳水解酶。

綜上所述,中性蛋白酶的應(yīng)用已經(jīng)滲透到生活的諸多方面,并且該類研究仍在繼續(xù),日后必將在更多的領(lǐng)域發(fā)揮其有益作用。

3 提高枯草芽孢桿菌中性蛋白酶活力的途徑

在一般情況下從自然界經(jīng)過簡單的分離篩選所得到的枯草芽孢桿菌雖然擁有了一定的產(chǎn)酶能力,但不能滿足規(guī)模性工業(yè)生產(chǎn)的要求,需要通過微生物菌種選育途徑和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化兩者結(jié)合提高酶的活力。

3.1 育種途徑

(1)誘變育種

誘變技術(shù)包括傳統(tǒng)誘變技術(shù)和復(fù)合誘變技術(shù)。傳統(tǒng)誘變技術(shù)根據(jù)誘變劑的不同分為物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變,原理是通過作用于細胞中的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,引發(fā)誘變,進而從大量變異菌株中選取優(yōu)良性狀的突變株。傳統(tǒng)誘變工作量較大,突變類型少,達不到預(yù)期誘變效果,因此在育種工作中常使用兩種或兩種以上的手段進行復(fù)合處理發(fā)揮協(xié)同作用提高誘變效應(yīng)。研究人員應(yīng)用紫外線、微波以及亞硝酸鹽處理等傳統(tǒng)誘變方法對枯草芽孢桿菌N19進行復(fù)合誘變,所得突變菌株UMN-26的中性蛋白酶產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了4倍,酶活性由158 U/mL增長至803 U/mL,且突變菌株表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性［18］。游玟娟等［19］以枯草芽孢桿菌As1.398為出發(fā)菌株,利用紫外線與亞硝酸復(fù)合誘變處理,用30W紫外線照射處理出發(fā)菌株60s篩選出誘變效果好的菌株,再用0.15 mol/L的亞硝酸處理20 min篩選得到穩(wěn)定突變株UN-11,所產(chǎn)中性蛋白酶活性可達2665.2U/mL,比出發(fā)菌株提高了75.3%?？梢姀?fù)合誘變是提高微生物產(chǎn)中性蛋白酶活力的有效途徑。目前,枯草芽孢桿菌誘變育種產(chǎn)中性蛋白酶的研究重點是通過誘變對菌株進行改良,突破或解除其原有代謝調(diào)控,使得所需代謝產(chǎn)物中性蛋白酶足量積累,進而實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、低耗和高效轉(zhuǎn)換。

(2)基因工程育種

1983年,嗜熱脂肪芽孢桿菌源中性蛋白酶的編碼基因首次被克隆并表達于枯草芽孢桿菌中［30］,自此開啟了中性蛋白酶的基因修飾研究?？莶菅挎邨U菌可以表達和分泌兩種中性蛋白酶(即A和B),其中A為主要的中性蛋白酶。編碼中性蛋白酶A的基因為nprE,位于基因組1 530.127～1 550.127 kb之間,基因編碼序列全長1 563 bp,能夠編碼521個氨基酸殘基的多肽［31］。WANGH等［32］從解淀粉芽孢桿菌K11菌株中克隆到中性蛋白酶編碼基因,應(yīng)用難轉(zhuǎn)化菌株的特異性遺傳操作方法,在枯草芽孢桿菌WB600菌株中構(gòu)建重組質(zhì)粒,在優(yōu)化條件下轉(zhuǎn)化菌株K11,通過優(yōu)化其發(fā)酵條件使菌株轉(zhuǎn)化體110N-6具有高活性和優(yōu)異的遺傳穩(wěn)定性。張敏等［33］利用sac B誘導(dǎo)基因和枯草芽孢桿菌蛋白酶雙缺陷突變株DB104構(gòu)建了一個對中性蛋白酶基因進行誘導(dǎo)表達的系統(tǒng),以解決枯草桿菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表達水平不高的問題,從而實現(xiàn)中性蛋白酶基因的高效表達,以大幅度地提高中性蛋白酶的產(chǎn)量,降低其生產(chǎn)成本。

(3)空間育種

微生物空間誘變育種的原理是利用衛(wèi)星、飛船等返回式航天器將篩選好的部分微生物帶到宇宙空間,在輻射、微重力、高真空、交變磁場等太空誘變因子的作用下,菌種發(fā)生遺傳性變異,經(jīng)空間誘變育種一定周期后返回地面進行比較和篩選,我國利用神舟五號宇宙飛船和第22顆返回式衛(wèi)星搭載枯草芽孢桿菌BS2進行首次重復(fù)空間誘變,返地后篩選中性蛋白酶高產(chǎn)菌株,獲得了菌株BSK-8,其中性蛋白酶活性比原始菌株提高了6.9倍,且產(chǎn)酶穩(wěn)定［34］,這一研究表明,空間育種可以作為枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶育種的一種有效誘變途徑。

3.2 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的活性、穩(wěn)定性、耐熱性等性質(zhì)決定其應(yīng)用范圍,這些特性受培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的影響。目前對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化首先通過單因素試驗確定最適培養(yǎng)基組分,再經(jīng)正交試驗或響應(yīng)曲面分析等優(yōu)化方法快速有效地確定發(fā)酵工藝中多因子系統(tǒng)的最佳條件［18,20,35-36］。劉穎等［20］通過單因素試驗和正交試驗對枯草芽孢桿菌10075菌株進行產(chǎn)酶優(yōu)化,結(jié)果表明其最適培養(yǎng)基碳源、氮源、無機鹽的種類及添加量為：麥芽糖8.0%,蛋白胨4.0%,MgSO40.08%；最佳發(fā)酵條件為：溫度37℃,初始pH值7.0,發(fā)酵時間42 h,最優(yōu)條件下中性蛋白酶酶活由最初的98.36 U/mL提高至353.45 U/mL。王東等［35］通過單因素試驗確定了一株產(chǎn)中性蛋白酶枯草芽孢桿菌的最適培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽和表面活性劑分別為：蔗糖、牛肉膏、CaCl2、吐溫-80；在此基礎(chǔ)上,通過Plackett-Burman試驗設(shè)計和響應(yīng)曲面分析優(yōu)化得出最佳培養(yǎng)條件為：蔗糖3%,牛肉膏2%,CaCl20.3%,吐溫-800.55%,發(fā)酵溫度37℃,初始pH值7.5,發(fā)酵時間50.4 h,接種量2.66%,最優(yōu)條件下所產(chǎn)中性蛋白酶酶活為143.54 U/mL,較原來提高了1.3倍。馬宏穎等［18］通過搖瓶發(fā)酵試驗確定枯草芽孢桿菌UMN-26的最佳發(fā)酵工藝為搖床轉(zhuǎn)速240 r/min,發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH 6.5,接種量2.5%,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵時間32 h,在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)所產(chǎn)中性蛋白酶活力可達1378 U/mL,是優(yōu)化前的1.7倍。由此可知,枯草芽孢桿菌所產(chǎn)中性蛋白酶活性,主要受碳源、氮源、無機鹽離子、表面活性劑等培養(yǎng)基組分,以及發(fā)酵溫度和時間、環(huán)境酸堿度和接種量等條件的影響。

4 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的分離純化

現(xiàn)有蛋白酶的分離純化方法分為三類［37］,即沉淀法(包括有機溶劑沉淀法、鹽析沉淀法、等電點沉淀法、熱變性沉淀法)、層析法(包括分子層析法、離子層析法、親和層析法)以及膜超濾法。

沉淀法是較為傳統(tǒng)的蛋白酶初步分離純化方法,其中有機溶劑沉淀法具有分辨率高、溶劑易除去的優(yōu)點,但容易破壞蛋白質(zhì)的氫鍵,引起蛋白酶變性失活,其中在常用的有機溶劑中丙酮的沉淀能力較強［38］。相比之下,鹽析沉淀法作用比較溫和不易引起酶的變性失活,常用分段鹽析的方法反復(fù)進行沉淀來提高純化倍數(shù),常選用的中性鹽是硫酸銨,鹽析沉淀法缺點是大量的鹽析劑會滯留在沉淀物中并伴有硫酸銨惡臭氣味。等電點沉淀法是通過將溶液的pH值調(diào)節(jié)到蛋白酶的等電點,減小溶液靜電荷從而達到分離的效果,操作較簡單且便于控制,但由于某些蛋白酶的等電點相差不大而使得分離的蛋白酶純度低。熱變性法是利用酶的熱穩(wěn)定性不同,通過控制溫度分離不同種類的蛋白酶,方法操作簡單,但過程不易控制容易導(dǎo)致酶失活變性。

層析法被廣泛應(yīng)用于蛋白酶的進一步分離純化,其中分子篩層析適用于含有不同分子大小的混合物分離,方法操作簡單迅速且對蛋白酶活性影響不大,但分辨率低。離子交換層析與分子篩層析相比特異性更高,可通過設(shè)置參數(shù)提高純化效率,但大量酸堿的使用會對環(huán)境造成危害。親和層析法是較上述兩種層析法更為高效的蛋白酶純化法,是通過在層析柱中放置具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子固相吸附劑,從而分離有親和力的蛋白質(zhì),再用洗脫劑進行洗脫分離結(jié)合的蛋白酶,但有時會因為分子的錯誤識別而吸附雜蛋白,且費用較為昂貴。

膜超濾法是利用膜的選擇性,以壓力差為推動力實現(xiàn)蛋白酶的分離。膜的原料多為醋酯纖維等高分子材料,超濾過程中不會引起蛋白酶活性的改變,不需熱處理故對熱敏性蛋白酶也較為安全,且濾膜可多次循環(huán)利用,但該方法使用必備條件是待分離的兩種產(chǎn)品分子質(zhì)量相差5倍或5倍以上。

鑒于現(xiàn)有蛋白酶分離純化方法都存在各自的優(yōu)勢與不足,故在酶的純化過程中通常是采用上述幾種有效方法進行組合并用以達到最佳的純化效果。趙忠潤等［15］考察了離子交換樹脂層析和工業(yè)級吸附型大孔樹脂純化枯草芽孢桿菌1398中性蛋白酶的效果,發(fā)現(xiàn)離子吸附純化能夠完全去除色素和異味物質(zhì),樹脂吸附也可以達到實驗室級預(yù)裝柱的分離效果。趙叢等［16］將含有雜蛋白的ZC-7中性蛋白酶通過硫酸銨鹽析分級分離,除雜后的蛋白酶經(jīng)過離子交換層析和凝膠層析純化,獲得了凝膠電泳條帶單一的蛋白樣,純化倍數(shù)為77.5。

5 結(jié)論

枯草芽孢桿菌在產(chǎn)酶工業(yè)上的應(yīng)用日漸增多,盡管國內(nèi)外對中性蛋白酶的研究相對較多,且其在工業(yè)上的應(yīng)用也日益廣泛,涵蓋了食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域,但相比于其他蛋白酶,中性蛋白酶活力相對較低,提高枯草芽孢桿菌中性蛋白酶活力仍是將來研究的重中之重,為了提高中性蛋白酶產(chǎn)量與活性,可以通過傳統(tǒng)誘變育種、基因工程育種甚至空間育種的方式,并結(jié)合優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分與發(fā)酵條件的手段實現(xiàn)。此外,關(guān)于枯草芽孢桿菌所產(chǎn)中性蛋白酶的結(jié)構(gòu)鑒定及其發(fā)揮酶活性的具體作用機制研究不夠深入,相關(guān)研究鮮有報道。隨著枯草芽孢桿菌遺傳信息的揭示以及蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展與成熟,枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的生物學(xué)特性以及作用機制將被逐漸明確。

參考文獻：

［1］王 霜,繆禮鴻,張明春,等.濃醬兼香型酒醅中產(chǎn)醬香芽孢桿菌的篩選及發(fā)酵風味成分分析［J］.中國釀造,2017,36(10)：61-65.

［2］宋 鵬,陳 亮,郭秀璞.產(chǎn)蛋白酶菌株的鑒定及酶學(xué)特性［J］.食品科學(xué),2012,33(13)：152-155.

［3］馬子賓,鄭鴻飛,劉均忠,等.一株海洋中性蛋白酶高產(chǎn)菌S-3685的鑒定及產(chǎn)酶條件［J］.漁業(yè)科學(xué)進展,2015,36(5)：131-137.

［4］WANGJ,ZHU JH,LIN W,et al.Screening for thestrain highly producing antagonistic substance Bacillus subtilis B47 by UV mutagenesis［J］.Agr Sci Technol,2008,9(4)：68-72.

［5］李玉環(huán),張 巖,時 威.枯草芽孢桿菌HS18堿性蛋白酶分離純化及其性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技,2012,33(19)：187-190.

［6］周曉輝,李 威,劉 浩.枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在禽畜養(yǎng)殖中的作用［J］.河北科技大學(xué)學(xué)報,2016,37(5)：503-508.

［7］GUO M,WU F,HAO G,et al.Bacillus subtilis improves immunity and diseaseresistancein rabbits［J］.Front Immunol,2017,8(2)：354.

［8］QIAO J,YU X,LIANG X,et al.Addition of plant-growth-promoting Bacillus subtilis PTS-394 on tomato rhizosphere has no durable impact on composition of root microbiome［J］.BMC Microbiol,2017,17(1)：131.

［9］LEIK,LIY,WANG Y,et al.Effect of dietary supplementation of Bacillus subtilis B10 on biochemical and molecular parameters in the serum and liver of high-fat diet-induced obesemice［J］.J Zhejiang Univ Sci B,2015,16(6)：487-495.

［10］劉煥煥,郭 楓,許文迪,等.基于生物發(fā)酵技術(shù)的中藥藥渣開發(fā)應(yīng)用研究進展［J］.中國釀造,2017,36(4)：6-9.

［11］謝全喜,亓秀曄,徐 輝,等.鼠李糖乳桿菌及枯草芽孢桿菌發(fā)酵對飼料品質(zhì)的影響［J］.中國釀造,2016,35(2)：53-56.

［12］SHIC,ZHANGY,YINY,et al.Amino acid and phosphorusdigestibility of fermented corn-soybean meal mixed feed with Bacillus subtilis and Enterococcusfaecium fed topigs［J］.J Anim Sci,2017,95(9)：3996-4004.

［13］和小黑,張文舉,魏曉燕.枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性改良研究進展［J］.中國飼料,2014(15)：8-10,16.

［14］肖懷秋.高活力產(chǎn)中性蛋白酶細菌菌株的選育及酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

［15］趙忠潤,陳 超,黃嬌芳,等.1398中性蛋白酶的色譜柱純化與分子鑒定［J］.生物技術(shù)進展,2014,4(3)：201-206.

［16］趙 叢,張 敏,王建玲,等.枯草芽孢桿菌ZC-7中性蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.中國生物工程雜志,2007,27(10)：28-33.

［17］吳京平.天然有機物對中性蛋白酶活力的影響［J］.現(xiàn)代食品科技,2006,22(4)：29-32.

［18］馬宏穎.中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及發(fā)酵條件研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

［19］游玟娟,馮剛利.紫外線與亞硝酸復(fù)合誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株［J］.食品科技,2010,35(10)：23-26.

［20］劉 穎,張彬彬,孫冰玉,等.枯草芽孢桿菌高產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品科學(xué),2014,35(13)：166-170.

［21］蒲 英.枯草芽孢桿菌H6-3中性蛋白酶特性研究及其降解飼料蛋白能力的評估［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

［22］趙彩艷,王二耀,陳付英,等.枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕生產(chǎn)益生菌飼料的研究［J］.飼料研究,2017(20)：28-31.

［23］趙玉山,任正偉,郝佃成,等.中性蛋白酶作為制備治療肛、腸病藥物的應(yīng)用及藥物：CN031388795［P］.2004-09-20.

［24］錢衛(wèi)平,汪 儉.生物技術(shù)與化妝品開發(fā)［J］.日用化學(xué)品學(xué),1996(6)：230-232.

［25］O‘GORMAN D,KIN T,PAWLICK R,et al.Clinical islet isolation outcomes with a highly purified neutral protease for pancreas dissociation［J］.Islets,2013,5(3)：111-115.

［26］STULL N D,BREITE A,MCCARTHY R,et al.Mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease［J］.J Vis Exp,2012,67：4515-4535.

［27］BAVAROT,CATTANEOG,SERRA I,et al.Immobilization of neutral proteasefrom Bacillussubtilis for regioselectivehydrolysisof acetylated nucleosides：application to capecitabine synthesis［J］.Molecules,2016,21(12)：1621.

［28］高丹丹,蘭家國,趙佩佩,等.中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白制備抗氧化肽的研究［J］.食品工業(yè)科技,2015,36(15)：229-233,238.

［29］王雪芹,邢榮娥,劉 松,等.鮐魚蛋白酶解工藝優(yōu)化及酶解物的抗氧化活性測定［J］.現(xiàn)代食品科技,2013,29(5)：1023-1028.

［30］FU JM,TAKG M,IMANAKA T,et al.Molecular cloning of a thermostable neutral protease gene from Bacillus stearothermophilus in a vector plasmid and its expression in Bacillus stearothermophilus and Bacillussubtilis［J］.J Bacteriol,1983,154(2)：831-837.

［31］YANG M Y,FEEEAEI E,HENNER D J.cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation［J］.J Bacteriol,1984,160(1)：15-21.

［32］WANGH,YANGL,PINGY,et al.Engineering of a Bacillusamyloliquefaciens strain with high neutral protease producing capacity and optimization of its fermentation conditions［J］.PLoS One,2016,11(1)：e0146373.

［33］張 敏,趙 叢,杜連祥,等.嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫中性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的表達、純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.中國科學(xué)(C輯：生命科學(xué)),2008,38(2)：166-172.

［34］夏承志.空間誘變、選育枯草芽孢桿菌中性蛋白酶高產(chǎn)菌株研究［D］.新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué),2007.

［35］王 東,榮家萍,唐自鐘,等.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的條件［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2016,35(1)：143-151.

［36］ZHU M J,CHENG JR,CHEN H T,et al.Optimization of neutral protease production from Bacillus subtilis：using agroindustrial residues as substrates and response surface methodology［J］.Biotechnol Appl Biochem,2013,60(3)：336-342.

［37］白延琴,辛小玲,來有志,等.枯草芽孢桿菌的分離篩選［J］.畜牧獸醫(yī)雜志,2013,32(2)：24-27,31.

［38］周艷利.酶的分離純化過程中的沉淀分離技術(shù)［J］.飲料工業(yè),2007,10(4)：1-3.