牛卵形巴貝斯蟲不同靶基因PCR檢測方法的比較

田萬年,李榮權(quán),薛書江,賈立軍,張守發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林 吉林 132101;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴貝斯蟲病(Babesia ovata)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)所引起的寄生蟲病。我國于1986年在河南省盧氏縣牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病,隨后1994年,在甘肅張家川回族自治縣牛體內(nèi)分離到卵形巴貝斯蟲[1]。目前牛卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過血液涂片,顯微鏡檢查為主,隱性感染牛的血液染蟲率較低,顯微鏡檢測易出現(xiàn)漏檢和誤診。PCR方法是一種快速、敏感、特異的診斷方法,已應(yīng)用牛卵形巴貝斯蟲病的診斷[2-3]。目前對該病不同靶基因進(jìn)行PCR方法的比較研究尚未見相關(guān)報道。因此,本試驗(yàn)根據(jù)GenBank已公布的卵形巴貝斯蟲AMA-1、CCTη和18S rRNA基因序列分別設(shè)計3對引物,從特異性、敏感性和臨床樣本檢出率方面進(jìn)行對比,為牛卵形巴貝斯蟲病的早期診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供快速、敏感的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 血液樣本采自吉林省琿春地區(qū)散養(yǎng)的延邊黃牛60份,無菌采取抗凝血,用PBS洗3次。存于-20℃?zhèn)溆?。同時制作了血液涂片,甲醛固定保存,供染色鏡檢。牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)玄學(xué)南教授惠贈。瑟氏泰勒蟲基因組DNA由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker等,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因序列(AY081192)、AMA-1基因序列(AB634843)和CCTη基因序列(AB367928),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了3對特異引物(見表1)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物信息

1.4 牛卵形巴貝斯蟲DNA標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA,抽提的DNA用50 μL TE溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR反應(yīng)條件 以提取的牛卵形巴貝斯蟲DNA為模板,以18S rRNA為靶基因PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán),最后72℃延伸7 min;以AMA-1為靶基因PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性20 s,58℃退火45 s,72℃延伸30 s,30個循環(huán),最后72℃延伸7 min;以CCTη為靶基因PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán),最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 特異性試驗(yàn) 以卵形巴貝斯蟲基因組DNA為試驗(yàn)樣本,以牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為對照樣本。分別應(yīng)用3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分析其特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 用紫外分光光度計測定已提取的卵形巴貝斯蟲DNA的D260nm值,計算DNA含量。以10倍為梯度進(jìn)行稀釋成7個不同濃度,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對比其敏感性。

1.8 臨床樣本的檢測試驗(yàn) 應(yīng)用3對引物對采自吉林省琿春地區(qū)的60份血液樣品進(jìn)行PCR檢測。比較3種靶基因PCR方法的陽性檢出率。同時,與血液涂片鏡檢相對比。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA濃度 將提取的牛卵形巴貝斯蟲基因組DNA經(jīng)紫外分光光度儀測定其D260nm值,DNA 含量為16 ng/μL。

2.2 特異性試驗(yàn) 將以牛卵形巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板,分別用3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳結(jié)果顯示,僅牛卵形巴貝斯蟲DNA樣本擴(kuò)增后出現(xiàn)特異性DNA條帶,而牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲均無此擴(kuò)增條帶出現(xiàn)(見圖1)。

圖1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn) 取提取的牛卵形巴貝斯蟲DNA按10倍倍比稀釋后,分別用不同靶基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2)。以18S rRNA靶基因的PCR敏感性最高,最小檢測 DNA含量為16 fg/μL;以 CCTη靶基因的PCR敏感性最低,最小檢測DNA含量為1.6 pg/μL;而以AMA-1靶基因的PCR敏感性最高,最小檢測DNA含量為1.6 fg/μL。

圖2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 臨床樣本檢測 對采自吉林省琿春地區(qū)60份血液樣本分別用3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以18S rRNA基因設(shè)計引物的陽性率為30%(18/60),以AMA-1基因設(shè)計引物的陽性率為25%(15/60),以CCTη基因設(shè)計引物的陽性率為21.67%(13/60),且血液涂片鏡檢診斷為陽性的樣本經(jīng)PCR診斷均為陽性。

表2 臨床樣本檢測結(jié)果

3 討論

牛卵形巴貝斯蟲病主要表現(xiàn)為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿,對牛危害較大,嚴(yán)重制約養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展。因此,對該病進(jìn)行早期準(zhǔn)確診斷是有效控制其蔓延的重要手段。目前,在所建立的牛卵形巴貝斯蟲病的診斷方法中,PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)是目前該病臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查的主要方法[4-5]。不同基因其開放閱讀框的穩(wěn)定性不同,其敏感性、特異性會受到影響[6]。因此篩選出牛卵形巴貝斯蟲病特異、敏感的PCR診斷方法是十分必要的。

18S rRNA為核糖體小亞基的DNA序列,該基因在不同蟲種間變異較大,在同種間具有較好的保守性,已廣泛應(yīng)用于病原的分類、鑒定的靶序列[7-8]。頂膜抗原1(AMA-1)最早在諾氏瘧原蟲中被鑒定出來,在瘧原蟲侵染宿主細(xì)胞中被認(rèn)為是不可或缺的抗原蛋白,AMA-1是蟲體入侵紅細(xì)胞之前以膜結(jié)合形式分泌到蟲體表面蛋白[9]。含t-復(fù)合多肽1(TCP-1)的伴侶素(Chaperonin)簡稱為CCT,CCT又稱Tric(TCP-1 ring complex)分子伴侶系統(tǒng)屬于分子伴侶素家族,CCTη是CCT的一個亞基,存在于細(xì)胞漿中異型寡聚蛋白[10]。黃國明等[1]對牛卵形巴貝斯蟲伴侶素CCTη基因進(jìn)行了克隆與生物信息學(xué)分析。本試驗(yàn)根據(jù)Gen-Bank上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA、AMA-1和CCTη基因序列設(shè)計3對引物,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從特異性、敏感性和臨床樣本檢出率方面比較。結(jié)果表明,18S rRNA的PCR方法敏感性最高,比AMA-1基因敏感10倍,比CCTη基因敏感100倍。臨床樣本檢測表明,以18S rRNA為靶基因設(shè)計引物PCR檢出率最高,陽性率為30%(18/60)。本試驗(yàn)通過對卵形巴貝斯蟲不同靶基因的PCR檢測比較,篩選出以18S rRNA基因PCR方法的敏感性和臨床樣本檢出率最高,為牛卵形巴貝斯蟲病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效方法。

參考文獻(xiàn):

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