侗族傳統(tǒng)腌魚中乳酸菌的分離鑒定與生物學(xué)特性

杜 斌， 吳文能， 王繼玥， 周笑犁， 余 旭

(貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550005)

貴州黔東南苗族、侗族自治州的傳統(tǒng)民族食品腌魚，主要是以稻田養(yǎng)殖的鯉魚為原料，將鯉魚由背部剖開并除去內(nèi)臟，鹽腌16～24 h后，拌入糯米飯、辣椒粉及其他輔助香料入壇(桶)，放置于避光陰涼的地方自然發(fā)酵而成。腌魚集甜、酸、辣、麻、咸于一體，口感軟嫩，味道鮮美，可生吃，亦可煎、炸、烤、蒸，是當(dāng)?shù)孛癖娬写腿说纳铣思央萚1-2]。但是由于傳統(tǒng)手工工藝制作過程復(fù)雜，發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，目前腌魚還沒有大規(guī)模生產(chǎn)和上市流通。乳酸菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的形成和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)變化起著至關(guān)重要的作用。目前對(duì)于少數(shù)民族傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中乳酸菌的研究還比較缺乏，為此，本研究以侗族傳統(tǒng)民族食品腌魚為材料，對(duì)成品中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，并利用16S rRNA序列分析方法進(jìn)行菌種鑒定，以期發(fā)現(xiàn)腌魚中特有的菌種資源，為改進(jìn)其傳統(tǒng)工藝，進(jìn)而發(fā)掘有益乳酸菌打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)用稻田鯉魚捕捉于貴州省黔東南州黎平縣，采用當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶傳統(tǒng)腌制方法腌制60d制成成品，另外收集當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的腌魚成品，共3份樣品。采樣時(shí)嚴(yán)格按照GB/T4789.1—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》操作。腌魚樣品分別編號(hào)為ZZY、CJY-1、CJY-2(ZZY為自制腌魚，CJY-1、CJY-2為采集樣品)。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 MRS肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；微量生化鑒定管，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；2720 Thermal Cycler PCR儀，Applied Biosystems；DYY-5型電泳儀，北京市六一儀器廠；FR980凝膠成像儀，上海復(fù)日科技儀器有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離純化 取3 g樣品，剪碎后放入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取200 μL 104～107倍稀釋液于含有2% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取有溶鈣圈的單菌落接種于MRS固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行多次劃線分離，挑選革蘭氏陽(yáng)性(G+)、過氧化氫酶陰性(H2O2-)的單菌落并進(jìn)行保藏。

1.3.2 生理生化鑒定 參考《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[3]，對(duì)分離純化的乳酸菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.3 16S rDNA分析

1.3.3.1 16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增 取單菌落置于離心管中，加入20 μL無菌蒸餾水重懸，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心5 min。上清中即含16S rDNA基因。采用細(xì)菌通用引物16S rDNA-F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，16S rDNA-R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCG CA-3′，以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增16S rDNA基因。

25 μL反應(yīng)體系：1 μL模板DNA，各2.5 μL引物(1 μmol/L)，12.5 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix，6.5 μL去離子水。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3.3.2 菌株同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將菌株序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析，運(yùn)用MEGA 7.0軟件的相鄰計(jì)算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判斷目的菌株的分類地位。

1.3.4 菌株生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸能力測(cè)定 將待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以未接種菌液的MRS培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每隔2 h取200 μL培養(yǎng)液，采用酶標(biāo)儀測(cè)定其D600 nm及培養(yǎng)液pH值。每個(gè)樣平行測(cè)定3次。

1.3.5 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 將分離菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別于15、20、30、37、45、50 ℃條件下培養(yǎng)24 h，以未接種菌液的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，D600 nm的測(cè)定方法同“1.3.4”節(jié)，研究溫度對(duì)待測(cè)菌株生長(zhǎng)代謝的影響。

1.3.6 NaCl濃度對(duì)分離菌株生長(zhǎng)代謝的影響 將分離菌株接種于含鹽量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以未接種菌液的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，D600 nm測(cè)定方法同“1.3.4”節(jié)。

1.3.7 蛋白酶活性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，略有改動(dòng)，分別以添加15%脫脂牛乳的MRS和營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基作為測(cè)定蛋白酶活性的專用培養(yǎng)基。將待測(cè)菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，無菌吸取100 μL培養(yǎng)液，接種于蛋白酶檢測(cè)專用培養(yǎng)基中，涂布均勻，于37 ℃培養(yǎng) 24 h，若菌落周圍有透明環(huán)，則為陽(yáng)性。

1.3.8 脂肪酶活性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，略有改動(dòng)，分別以添加15%牛油、0.5%中性紅指示劑的MRS和營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基作為測(cè)定脂肪酶活性的專用培養(yǎng)基。將待測(cè)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，無菌吸取 100 μL 培養(yǎng)液，接種于脂肪酶檢測(cè)專用培養(yǎng)基中，涂布均勻，于37 ℃培養(yǎng)24 h，若培養(yǎng)基上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

本試驗(yàn)采用MRS選擇性培養(yǎng)基，對(duì)3個(gè)樣品中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌群進(jìn)行分離及純化。經(jīng)顯微觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)，得到G+和H2O2-菌株共16株，初步鑒定均為乳酸菌。其中從樣品ZZY中分離得到7株，從CJY-1中分離得到6株，從CJY-2中分離得到3株。所獲菌株的菌落形態(tài)多為邊緣整齊、表面光滑或稍粗糙，MRS培養(yǎng)基中的菌落呈乳白色或淺黃色凸起的圓形。鏡檢觀察全部為桿狀或短桿狀，成單、對(duì)或堆排列。

2.2 生理生化鑒定

對(duì)上述16株乳酸菌進(jìn)一步進(jìn)行生理生化鑒定試驗(yàn)，結(jié)果見表1。可以看出，所有乳酸菌產(chǎn)酸，不可水解明膠和淀粉；查閱《一般細(xì)菌常用鑒定方法》《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[3，6]，初步確定乳酸菌主要為消化乳桿菌(8株)、植物乳桿菌(4株)、草乳桿菌(2株)和發(fā)酵乳桿菌(2株)?？梢钥闯?，消化乳桿菌為侗族傳統(tǒng)腌魚產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌之一，從菌株數(shù)量來看較多。該結(jié)果與鹽干帶魚微生物區(qū)系研究較為相似[7]，但與其他傳統(tǒng)肉制品的微生物區(qū)系研究具有較大的差異，如干腌牛肉(Cecina de Leon)以及云南干腌火腿中乳酸菌屬細(xì)菌以植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌[8]，這可能是由加工原料及加工工藝的不同造成的。

2.3 16S rDNA分析

根據(jù)生化鑒定結(jié)果，分別對(duì)菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3 和CJY2-3進(jìn)行16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，如圖1所示，4株待測(cè)菌條帶明亮清晰，且無明顯拖尾，均在1 500 bp附近，可以進(jìn)行序列檢測(cè)。

2.4 測(cè)序結(jié)果分析

將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，通過BLAST，將所測(cè)定的菌株序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株序列進(jìn)行比對(duì)，尋找與目的基因序列同源性最高的已分類的菌種，然后用軟件MEGA 6進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，所分離菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3和CJY2-3的遺傳進(jìn)化分別與已知消化乳桿菌(LactobacillusalimentariusW369、L.alimentariusIMAU80036)、已知植物乳桿菌(L.plantarumNi344、L.plantarumWCFS1)、已知草乳桿菌(L.graminisLMG 9825)和已知發(fā)酵乳桿菌(L.fermentumKFC、L.fermentumM17-1)同處于一個(gè)分支，同源性高達(dá)99%。這一結(jié)果與生化鑒定結(jié)果完全一致。

2.5 菌株生長(zhǎng)特性

2.5.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 對(duì)菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3和CJY2-3進(jìn)行生長(zhǎng)曲線研究。由圖3可知，4株乳酸菌中只有草乳桿菌ZZY-3在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，18 h后才趨于平緩生長(zhǎng)，而其他4株菌均表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)特性，在4 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h后達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，比較D600 nm可知，消化乳桿菌ZZY-6、植物乳桿菌CJY1-1和發(fā)酵乳桿菌CJY2-3的生長(zhǎng)速率要高于草乳桿菌ZZY-3，更早到達(dá)平臺(tái)期。

表1分離菌株的生理生化鑒定

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性，“±”表示11%～89%的菌株為陽(yáng)性。表2同。

2.5.2 產(chǎn)酸性能的測(cè)定 圖4表明，ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3 和CJY2-3等4株待測(cè)菌株均有較好的產(chǎn)酸能力，培養(yǎng) 4 h 后，菌株ZZY-6、CJY1-1和CJY2-3發(fā)酵液的pH值均快速下降。培養(yǎng)14 h后，這3株菌培養(yǎng)pH值均下降到4.0左右。而菌株ZZY-3培養(yǎng)16 h后發(fā)酵液pH值才降到4.0，這與菌株生長(zhǎng)情況基本是對(duì)應(yīng)的。結(jié)果表明，分離菌株符合發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的要求，可快速使環(huán)境 pH值下降，因此能抑制腐敗菌的生長(zhǎng)[9]，提高產(chǎn)品的安全性。

2.5.3 發(fā)酵溫度對(duì)分離菌株生長(zhǎng)代謝的影響 溫度對(duì)于菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酸影響較大，由圖5可知，環(huán)境溫度在15～37 ℃范圍內(nèi)時(shí)，分離菌株的D600 nm逐漸升高，當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，其D600 nm開始下降；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，菌株的生長(zhǎng)受到極大抑制，因此分離菌株最適發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.5.4 NaCl濃度對(duì)生長(zhǎng)的影響 傳統(tǒng)腌魚腌制時(shí)通常要加入一定量的NaCl，魚體內(nèi)NaCl含量較高，而對(duì)NaCl的耐受能力是選擇發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的一個(gè)重要因素， 篩選出的菌株通常要求至少能夠在6%的NaCl濃度下正常生長(zhǎng)[10]。本試驗(yàn)考察了NaCl濃度對(duì)4株菌株生長(zhǎng)的影響，如圖6所示，隨著NaCl濃度的升高，4株菌株的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，隨著NaCl濃度增大，抑制作用越強(qiáng)；當(dāng)NaCl濃度在0～4%時(shí)，菌株受到的抑制作用較?。划?dāng)NaCl濃度達(dá)到6%時(shí)，菌株生長(zhǎng)力均有所下降但仍能生長(zhǎng)，表明這4株菌對(duì)NaCl具有一定的耐受能力，該分離菌株在腌魚發(fā)酵過程中有較強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力，可作為相關(guān)肉制品的備選發(fā)酵劑。

2.5.5 蛋白酶活性與脂肪酶活性測(cè)定 乳酸菌蛋白酶活性與脂肪酶活性，是篩選性質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定性強(qiáng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株的主要指標(biāo)[11-13]。本研究初步分析了4個(gè)菌株的相應(yīng)酶活性。由表2可知，只有植物乳桿菌CJY1-1具有蛋白酶活性，而其余3株菌株均未檢測(cè)到蛋白酶活性；這4株菌株脂肪酶的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明分離得到的菌株均不具有脂肪酶活性。

表2分離菌株的蛋白酶活性和脂肪酶活性

3 結(jié)論

由于地域不同以及制作工藝的差異，侗族傳統(tǒng)腌魚中優(yōu)勢(shì)乳酸菌群也略有不同。本研究從3份樣品中共分離出16株乳酸菌。經(jīng)生理生化鑒定，初步確定乳酸菌主要為消化乳桿菌(8株)、植物乳桿菌(4株)、草乳桿菌(2株)和發(fā)酵乳桿菌(2株)，分別選取1株菌株，通過16S rDNA測(cè)序分析進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。對(duì)分離菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，所得菌株均具有較好的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸性能，并且表現(xiàn)出較高的耐鹽能力，而且檢測(cè)到植物乳桿菌CJY1-1具有一定的蛋白酶活性，這些研究數(shù)據(jù)為了解侗族傳統(tǒng)腌魚中的乳酸菌群、揭示其發(fā)酵機(jī)制，以及工業(yè)化實(shí)行純菌種生產(chǎn)的腌魚產(chǎn)品提供了菌種支持，并為發(fā)掘侗族傳統(tǒng)腌魚中的益生乳酸菌打下了基礎(chǔ)。

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