甜菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)及部分激素對干旱脅迫的響應

李國龍， 孫亞卿， 邵世勤， 張永豐

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

干旱是對植物影響較大的逆境生態(tài)因子，也是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要制約因素[1-3]。干旱脅迫使植物細胞分裂，細胞增長被顯著抑制，植株生長緩慢；使植物體內(nèi)活性氧代謝平衡被破壞，大量自由基在細胞內(nèi)產(chǎn)生，膜質(zhì)過氧化程度加劇，使膜系統(tǒng)受到損傷甚至損壞，嚴重時導致細胞組織解體[4-6]。植物對干旱脅迫的響應機制一直是植物生理生態(tài)學研究的熱點，特別是近年來，隨著分子生物學思想和方法的不斷滲入，推動該領域的研究與探索步入一個充滿活力的新階段[7]。目前，圍繞干旱脅迫下植物表觀形態(tài)及生理生化應答機制的研究較多[8-12]。然而，植物抗旱性是受多個基因控制的復雜數(shù)量性狀，涉及細胞滲透調(diào)節(jié)能力、內(nèi)源激素調(diào)控能力、膜質(zhì)抗氧化能力、蛋白質(zhì)抗脫水能力等諸多途徑，因此，進一步深入研究植物耐旱性的生理響應機制，明確起關鍵作用的主效途徑，可為下一步有目的地開展抗旱基因組、蛋白組及代謝組研究提供依據(jù)。

甜菜(BetavulgarisL .)是我國重要的糖料作物和經(jīng)濟作物之一，其種植區(qū)域主要分布在我國東北、西北和華北廣大地區(qū)，該區(qū)域可利用水資源相對匱乏，周期性或難以預期的干旱已成為限制甜菜生產(chǎn)的主要因素[13-14]。除了依賴高效節(jié)水的現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)灌溉措施來解決這一問題，最大限度地挖掘甜菜自身的抗旱潛力、培育甜菜抗旱新品種是另一條有效途徑。而明確不同抗旱性甜菜對干旱的生理響應差異，闡明其抗旱的主要生理途徑，明確抗旱相關的重要生理指標，對抗旱甜菜品種的篩選和培育有重要的現(xiàn)實意義。為此，本試驗對甜菜幼苗進行不同程度的水分處理，分析不同程度水分虧缺及復水后甜菜幼苗在可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)及脫落酸、生長素等部分內(nèi)源激素方面的生理響應，探討相關生理參數(shù)與甜菜抗旱性的關系，以期為進一步研究甜菜對干旱脅迫的響應機制和篩選甜菜耐旱性品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

供試材料為強抗旱品種HI0466(瑞士先正達公司選育)和弱抗旱性品種KWS9454(德國KWS公司選育)，品種抗旱性鑒定工作已經(jīng)得以開展[15]。本試驗于2016年4—10月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學甜菜生理研究所進行。采用室內(nèi)盆栽試驗，選取相同規(guī)格60 cm×40 cm×20 cm的培養(yǎng)箱，每箱裝入 35 kg 試驗田表土并伴入適量的緩釋肥料。土壤田間持水量、永久萎蔫系數(shù)分別為21%、7.5%，土壤pH值為6.8。幼苗培育在人工氣候室進行，氣候室參數(shù)設置為溫度25 ℃，光—暗周期 14 h—10 h。每箱留健壯幼苗30株，在幼苗生長至6張真葉時開始進行脅迫處理。對照每箱澆灌6.5 L水，使土壤含水量維持在飽和含水量的75%～80%，每天06：00通過稱質(zhì)量法對土壤含水量進行監(jiān)測；脅迫處理停止?jié)菜{迫持續(xù)5 d后復水至對照水平。分別于處理后第1、3、5天(分別記作T1、T2、T3)和復水后第1、2天(分別記作T4、T5)取對照和處理植株長勢一致的完全展開的第3、4張葉進行相關生理指標的測定。

1.2 測定項目與方法

可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[16]；游離脯氨酸含量的測定采用茚三酮法[16]；可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍G-250法[17]；甜菜堿含量的測定采用化學比色法[18]；K+含量的測定采用火焰光度計法[19]；吲哚-3-乙酸(簡稱IAA)、脫落酸(簡稱ABA)含量的測定采用酶聯(lián)吸附免疫分析法[18]；葉水勢的測定采用壓力室法，利用ZLZ-A型植物水分測定儀在09：00測定[20]；

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 13.0進行分析與處理。其中圖表制作采用Excel 2007，而不同處理間差異顯著性分析及主成分分析采用SPSS 13.0，圖中數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值。

2 結果與分析

2.1 水分脅迫下甜菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)能力的響應

2.1.1 甜菜幼苗葉片可溶性糖含量對水分脅迫的響應 水分脅迫下植物體內(nèi)可通過增加細胞原生質(zhì)濃度來起到抗脫水作用，可溶性糖就屬于該類物質(zhì)的一種。從圖1可以看出，在正常供水條件下，不同抗旱性甜菜葉片可溶性糖含量變化基本趨于穩(wěn)定，波動不大，不同抗旱性品種間差異不顯著。在脅迫第1天時，與對照差異不顯著；隨著脅迫程度增加，不同抗旱性品種甜菜葉片可溶性糖含量均表現(xiàn)出升高趨勢，但是抗旱品種HI0466增幅較明顯，在脅迫第3、5天時，其可溶性糖含量分別較對照提高1.53、2.97倍，而弱抗旱品種KWS9545分別僅較對照提高了0.76、1.19倍，不同抗旱品種間差異顯著。復水后2個品種葉片可溶性糖含量均呈下降恢復趨勢，但在復水2 d內(nèi)均未恢復到正常對照水平。

2.1.2 甜菜幼苗葉片可溶性蛋白含量對水分脅迫的響應 干旱脅迫下植物常會作出增加蛋白合成量或新合成某些蛋白的適應性調(diào)節(jié)反應，該類蛋白的產(chǎn)生與植物的干旱脅迫時間、強度及物種的類型、器官相關[21-25]。由圖2可知，在正常供水條件下，不同抗旱性品種甜菜葉片可溶性蛋白含量變化平穩(wěn)，不同品種間不存在顯著差異。在水分脅迫處理下，不同抗旱性品種可溶性蛋白質(zhì)含量變化均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。在脅迫前幾天，水分脅迫誘導使2個供試品種可溶性蛋白質(zhì)含量均明顯升高，但抗旱性強的品種HI0466可溶性蛋白質(zhì)含量增幅較大，在脅迫第3天時最大值時提高為弱抗旱品種KWS9554的1.15倍，品種間差異顯著；當脅迫持續(xù)到第5天時，可能由于脅迫程度加劇，2個品種葉片可溶性蛋白質(zhì)含量均開始下降，但是不同抗旱性品種下降幅度明顯不同，抗旱品種HI0466可維持較低的降幅而保持相對較高的可溶性蛋白質(zhì)含量，而弱抗旱品種KWS9554可溶性蛋白質(zhì)含量迅速下降至較低水平；復水2 d后可溶性蛋白質(zhì)含量均可逐步恢復到對照水平。

2.1.3 甜菜幼苗葉片游離脯氨酸含量對水分脅迫的響應 作為植物體內(nèi)水溶性最大的氨基酸，脯氨酸一方面可降低細胞滲透勢，起到滲透調(diào)節(jié)作用，另一方面在保護大分子物質(zhì)穩(wěn)定性方面有一定作用。大量研究表明，干旱會使植物體內(nèi)游離脯氨酸大量累積。在本研究中，在正常供水條件下，不同抗旱性甜菜品種葉片脯氨酸含量維持在穩(wěn)定的低水平狀態(tài)；在水分脅迫處理下，供試甜菜葉片脯氨酸含量均呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，但增加幅度明顯不同，強抗旱品種HI0466增幅顯著，在脅迫第1、3、5天時分別提高到弱抗旱材料KWS9454的1.98、1.54、1.90倍，表現(xiàn)為水分脅迫下不同抗旱性品種間脯氨酸含量差異顯著；在復水后，供試材料葉片脯氨酸含量開始逐漸降低(圖3)。

2.1.4 甜菜幼苗葉片甜菜堿含量對水分脅迫的響應 甜菜堿是植物體內(nèi)另一類理想的親和性滲透物質(zhì)，在抗逆中具有滲透調(diào)節(jié)、穩(wěn)定生物大分子的作用。由圖4可知，在正常供水條件下，不同抗旱性品種甜菜葉片甜菜堿含量(干質(zhì)量)在 0.5～1.0 μmol/g范圍內(nèi)波動，變化趨勢比較穩(wěn)定。在水分脅迫下，不同品種甜菜堿含量出現(xiàn)不同程度的積累?？购灯贩NHI0466在脅迫程度較輕時其葉片甜菜堿含量未出現(xiàn)及時響應，以至在脅迫第1天時其葉片甜菜堿含量仍維持在對照水平，但弱抗旱材料KWS9454略有升高。隨著脅迫的進行，在脅迫第3～5天內(nèi)，2個供試材料的葉片甜菜堿含量均表現(xiàn)為快速大量累積并達到最大值，但累積幅度差異顯著?？购挡牧螲I0466的增幅明顯高于KWS9454，在脅迫第3、5天時，抗旱材料HI0466葉片甜菜堿含量分別提高到KWS9454的1.64、1.41倍，不同抗旱性品種間差異顯著。復水解除脅迫后，不同品種組織內(nèi)的甜菜堿含量開始緩慢下降，但在復水2 d后仍保持相對較高的水平，未能在短時間內(nèi)恢復到對照水平。

2.1.5 甜菜幼苗葉片K+含量對水分脅迫的響應 作為離子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，K+可通過調(diào)節(jié)液泡的滲透勢來維持細胞膨壓等生理過程。圖5表明，在正常供水情況下，葉片K+含量變化較平緩，品種間無明顯差異。在水分脅迫第1天時各組別K+含量無顯著變化，基本維持在對照水平。進一步脅迫條件下，供試2個品種葉片K+含量均開始快速升高，在脅迫第5天時K+含量均達到最高值，但在整個脅迫過程中，不同品種間變化幅度接近，不同抗旱性品種間差異不顯著。復水后，各處理K+含量均快速下降并恢復到對照水平。

2.1.6 甜菜幼苗葉片水勢對水分脅迫的響應 植物細胞的水勢對干旱等逆境脅迫較為敏感，且植物細胞的滲透調(diào)節(jié)作用是植物增強抗逆性、適應環(huán)境的基礎[26]。從圖6可以看出，不同抗旱性品種在正常水分條件下水勢變化穩(wěn)定，無明顯差別；在水分脅迫條件下，2個甜菜品種水勢均呈現(xiàn)下降趨勢。在脅迫第1天時，不同抗旱性品種下降幅度相近，差異不顯著；隨著脅迫程度進一步加大，抗旱品種HI0466水勢下降幅度增加，且2個品種間差異顯著。這可能與抗旱品種HI0466細胞內(nèi)大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的快速大量累積有關，使其滲透勢維持在較低的水平，在脅迫第5天時葉片水勢達到最低值?？购灯贩NHI0466維持較低滲透勢可避免細胞內(nèi)水分的大量流失，提高其保水能力，增強抗旱性。在復水2 d后，水勢均可再次快速上升并接近對照水平。

2.2 水分脅迫下甜菜幼苗葉片內(nèi)源激素的響應

2.2.1 甜菜幼苗葉片IAA含量對水分脅迫的響應 IAA作為促進植物生長的關鍵內(nèi)源激素，主要由植物頂端分生組織和正在生長的葉片來合成，并通過極性的方式運輸?shù)狡渌M織器官，其含量與生長的各組織之間保持一種互動的平衡反饋關系。由圖7可以看出，本研究中在正常水分條件下，不同抗旱性甜菜品種葉片IAA含量均維持穩(wěn)定，且HI0466略高于KWS9454。在水分脅迫下，抗旱材料HI0466葉片在脅迫第1天 時的IAA含量未發(fā)生明顯變化，而弱抗旱材料KWS9454葉片IAA含量顯著降低。隨著脅迫的持續(xù)，不同品種葉片IAA含量均表現(xiàn)為逐漸降低，在脅迫第5天時均達到最低值，但不同抗旱性品種降低幅度明顯不同，弱抗旱材料KWS9454降低幅度顯著高于抗旱材料HI0466，在脅迫第3、5天分別較抗旱材料HI0466低20.91%、27.24%，不同抗旱性品種間葉片IAA含量差異顯著。復水2 d后不同抗旱性品種甜菜葉片IAA含量均有較大幅度的升高，HI0466基本可恢復到對照水平，但KWS9454的恢復速度較慢。

2.2.2 甜菜幼苗葉片ABA含量對水分脅迫的響應 脫落酸參與植物對多種逆境的響應，諸多研究表明，干旱會誘導植物體內(nèi)源ABA的響應，引發(fā)植物的水分虧缺反應，通過調(diào)節(jié)氣孔、調(diào)整保衛(wèi)細胞離子通道、降低鈣調(diào)素蛋白的轉(zhuǎn)錄水平等方面的影響，增加逆境存活機會[27-29]。由圖8可以看出，在水分充足的條件下，不同抗旱性甜菜葉片內(nèi)ABA含量穩(wěn)定。在水分脅迫下，不同抗旱性甜菜葉片的ABA含量響應明顯不同，其中抗旱品種HI0466的響應迅速，在脅迫第1天時，葉片的ABA含量就快速升高。在隨后的脅迫過程中，供試品種葉片的ABA含量均出現(xiàn)不同程度的響應增加，在脅迫第5天時，葉片ABA含量均達到最高值，但同樣表現(xiàn)出抗旱品種HI0466的響應顯著，葉片ABA含量增加幅度較大，含量較高，在水分脅迫下，不同抗旱性品種間葉片ABA含量差異顯著。復水 2 d 后葉片ABA含量均有較大幅度的下降，并與對照水平接近。

2.3 甜菜抗旱性鑒定指標的評價

由于不同指標對抗旱性貢獻的權重各異，甜菜不同抗旱性品種在不同水分狀況下各單項生理指標的響應不盡相同，且各指標間關系復雜，以單一指標對甜菜抗旱性進行評價結果片面，應對其進行綜合分析評價。利用SPSS 13.0軟件對8項生理指標進行主成分分析，由表1可以看出，主成分分析特征值中2個成分的累積貢獻率達到76.153%，具有較強的代表性，提取的2個主成分基本上代表了8個原始指標的絕大部分信息。其中決定第一主成分大小的主要有脯氨酸含量、甜菜堿含量、細胞水勢3個生理指標，系數(shù)分別為0.960、0.900、-0.908，這3個指標屬于滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)；決定第二主成分大小的主要有ABA含量，系數(shù)為0.968，該指標屬于內(nèi)源激素調(diào)控系統(tǒng)。因此，通過主成分分析表明，在甜菜苗期，脯氨酸含量、甜菜堿含量、細胞水勢、ABA含量均可作為甜菜抗旱性的鑒定指標。

表1各生理指標主成分的特征向量貢獻率

注：“*”表示各指標間差異顯著(P<0.05)；“**”表示各指標間差異極顯著(P<0.01)。

3 討論與結論

滲透調(diào)節(jié)是植物抵御干旱逆境的一種重要方式，也是植物在干旱脅迫下誘導保護性應答的一種重要生理機制[30-31]，目前已有關于多種作物的大量研究報道，出現(xiàn)2種不同的觀點，一種認為滲透調(diào)節(jié)參與作物的抗旱，滲透調(diào)節(jié)能力較高的作物具有較強的抗旱性。如對高粱、小麥、玉米的研究結果表明，抗旱性強的品種其滲透調(diào)節(jié)能力可在干旱脅迫下維持較高的水平[32-34]。另一種則認為滲透調(diào)節(jié)能力與作物品種抗旱性間不存在顯著相關關系，如Jones在研究高粱時發(fā)現(xiàn)，水分脅迫下不同抗旱性高粱品種的滲透調(diào)節(jié)能力沒有表現(xiàn)出明顯差異[35]。本研究對抗旱性差異明顯的2個典型甜菜品種在苗期不同程度水分脅迫下其滲透調(diào)節(jié)能力變化的分析表明，甜菜苗期的滲透調(diào)節(jié)能力與其品種抗旱性強弱間存在相關性，抗旱能力強的甜菜品種其滲透調(diào)節(jié)能力也相對較強，這與第一種研究的觀點一致。同時本試驗結果也表明，滲透調(diào)節(jié)能力在甜菜苗期的作用與脅迫程度有關，在不同脅迫程度下其滲透調(diào)節(jié)能力表現(xiàn)不同。在脅迫程度較輕時，不同抗旱性甜菜滲透調(diào)節(jié)能力維持相對平緩的狀態(tài)，品種間差異不顯著。隨著脅迫程度的增加，在中度甚至重度脅迫時，抗旱品種的滲透調(diào)節(jié)才出現(xiàn)顯著增強的趨勢。這可能由于不同品種的抗旱機制存在差異，導致在響應不同干旱脅迫時其滲透調(diào)節(jié)能力存在一定的局限性。滲透能力的強弱主要依賴于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、甜菜堿、K+、Na+等[36]。近年來國內(nèi)外諸多學者對小麥、高粱、水稻、鷹嘴豆等許多作物的研究表明，干旱脅迫下細胞內(nèi)會通過不斷累積如脯氨酸、可溶性糖、K+等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應，降低細胞滲透勢，提高保水能力，維持細胞膨壓，從而增強作物對干旱的耐受性，但不同作物在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累方面存在一定差異[37-40]。從本研究的結果來看，在干旱脅迫下，抗旱能力強的甜菜苗期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應主要體現(xiàn)在脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖的積累，進而使甜菜細胞滲透勢維持在較低水平，有效地提高了保水能力，減少了水分的散失，提高了甜菜對水分脅迫的耐受性。其可能原因在于不同抗旱性甜菜存在不同的等位基因，在水分脅迫下控制上述滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的基因存在表達差異，造成其代謝過程和強度不同。

已有研究證實，植物激素對應答水分脅迫起重要的調(diào)控作用，對外界脅迫因子的反應極其敏感，在水分脅迫下呈現(xiàn)不同的響應機制[41-42]。在對小麥、大麥、水稻、玉米、豌豆等的研究中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下ABA、IAA含量均出現(xiàn)不同程度的響應，但規(guī)律不盡一致[43-47]。本研究結果表明，干旱脅迫下抗旱甜菜品種葉片ABA含量隨脅迫程度的增加而增加，IAA含量則相反，且水分脅迫程度較大時抗旱品種增幅顯著，并在復水后可產(chǎn)生補償效應。ABA作為“脅迫激素”，在干旱刺激下在抗旱品種內(nèi)大量合成并在地上部分累積，可能對促進抗旱品種氣孔關閉、減少水分散失起到重要作用。當然，植物激素在生長過程中的調(diào)控作用除了表現(xiàn)在其絕對含量外，激素間的相對平衡也非常重要?？购敌詮姷钠贩N在水分脅迫下各激素間消長協(xié)調(diào)平衡能力較好，也可能是它們在脅迫中受抑制較小的另一原因。而有關脅迫條件下各激素間協(xié)調(diào)平衡的復雜關系及其相關機制，還應進一步研究。

作物的抗旱性是由多個因素交互形成的一種綜合性狀，不同抗旱生理指標對作物干旱脅迫的響應敏感程度不同[48-49]，因此采用某種單一指標對抗旱性進行評價時結果將會片面單一，應通過綜合評價方法對抗旱相關生理指標進行系統(tǒng)評價才更具有實際意義。目前報道的抗旱性綜合評價方法主要有主成分分析法、隸屬函數(shù)法、灰色關聯(lián)分析法、聚類分析法等[50-52]。本研究通過主成分分析法對8個甜菜品種的抗旱指標進行了綜合評價，其中在隸屬的2個主成分中，脯氨酸含量、甜菜堿含量、細胞水勢、ABA含量對干旱脅迫最為敏感，對抗旱性的貢獻率也最大，可作為甜菜苗期抗旱性評價的有效參考指標。

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國家民政局官網(wǎng)首頁主要職責第二條為：承擔依法對社會團體、基金會、民辦非企業(yè)單位進行登記管理和監(jiān)察責任。據(jù)《關于城鎮(zhèn)民辦非營利性醫(yī)療機構進行民辦非企業(yè)單位登記有關問題的通知》，民辦非營利性醫(yī)療機構由民政部門承擔登記管理和監(jiān)察責任。進行年檢管理，年檢方式為送審。中華人民共和國民政部令第27號《民辦非企業(yè)單位年度檢查辦法》第五條:民辦非企業(yè)單位接受年檢時應當提交的材料包括財務會計報告；第六條：年檢的主要內(nèi)容包括財務狀況、資金來源和保用情況；但未將提供注冊會計師審計報告作為必須報送的年檢材料之一。其相關內(nèi)設機構及職能中未明確具體承擔相應監(jiān)管職責的處室，僅見承擔部內(nèi)及所屬預算管理單位的財務監(jiān)管。

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