對氟苯甲醛縮去甲去氫斑蝥素酰亞胺的合成及熒光性質(zhì)研究

王 威，曾 造*,2

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)化工實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，貴州 畢節(jié) 551700)

斑蝥素是從傳統(tǒng)中藥斑蝥蟲中提取出來的具有抗菌性藥物，它對腫瘤、癌癥具有很好的治療效果，具有增加白細(xì)胞數(shù)、不克制免疫系統(tǒng)等功效[1]。但是，斑蝥素有劇毒會對人體消化系統(tǒng)、肝臟等有很大的副作用[2]，這也限制了它在醫(yī)療上的推廣使用。斑蝥素的衍生物-去甲去氫斑蝥素酰亞胺類化合物具有良好的抗菌、抗癌、抗腫瘤等生物活性[3]，且該類藥物的毒性比斑蝥素低。研究表明，氟代苯甲醛可用于合成抗病毒藥、解熱鎮(zhèn)痛消炎藥[4]。為了合成藥用價(jià)值高、毒副作用小的新型藥物，本文以呋喃和順丁烯二酸酐為原料，合成對氟苯甲醛縮去甲去氫斑蝥素酰亞胺(a)，合成路線見圖1。并通過熒光光譜法研究了目標(biāo)化合物與牛血清蛋白的相互作用，探索其猝滅機(jī)理、猝滅常數(shù)和作用力類型等，為了解該類藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸、儲存和作用機(jī)理等信息提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 目標(biāo)產(chǎn)物(a)合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

儀器：600 MHz 核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標(biāo)，瑞士 bruker 公司)；F-2007 FL 熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；超聲清洗儀(上海冠特超聲有限公司)；電子分析天平；冷凍藥品保存柜(中科美菱)。

藥品：四氫呋喃，呋喃，順丁烯二酸酐，對氟苯甲醛，牛血清蛋白(美國Sigma公司)，Tris-HCL緩沖溶液(含0.1 mol/L的NaCl)pH值=7.4，實(shí)驗(yàn)試劑保存在4℃下，備用。

1.2 目標(biāo)產(chǎn)物的合成

參照文獻(xiàn)[5]稱取9.80 g(0.1 mol)順丁烯二酸酐于反應(yīng)容器中，加入適量的乙醚使其全部溶解。在室溫下滴加8.70 mL(0.12 mol)呋喃并不斷攪拌25 min，密封靜置過夜，有白色晶體析出，過濾，稱重得12.6 g白色針狀晶體物質(zhì)去甲去氫斑蝥素(1)，用無水乙醇重結(jié)晶，產(chǎn)率66.7%。參照文獻(xiàn)[6]的合成方法，稱取1.66g(0.01 mol)去甲去氫斑蝥素于100 mL的三頸燒瓶中，加入適量的無水乙醇使其剛好溶解，待化合物(1)全部溶解后，緩緩滴加1.00 g(0.02 mol)水合肼，加熱回流20 h，冷卻結(jié)晶抽濾，用無水乙醇重結(jié)晶、干燥稱重得1.2 g的白色產(chǎn)物N-氨基去甲去氫斑蝥素酰亞胺(2)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]的合成方法，稱取1.08 g化合物(2)于250 mL的三頸燒瓶中，加入適量的無水乙醇使其全部溶解，加入6.00～1.2 mmol的對氟苯甲醛，用TLC追蹤反應(yīng)，加熱回流5h，冷卻結(jié)晶后抽濾，以無水乙醇為溶劑加熱溶解重結(jié)晶，干燥后得目標(biāo)產(chǎn)物a。

1.3 熒光分光實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL容量瓶中加入1.0 mL Tris-HCL溶液(pH值=7.4)、1.0 mLBSA溶液和不同體積的去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮對氟苯甲醛溶液，并用超純水定容，搖勻靜置15 min。分別在290、300、310 K的恒溫水浴鍋中恒溫40 min,發(fā)射狹縫和激發(fā)狹縫的寬度都為5 nm，以286為激發(fā)波長在300～450 nm掃描產(chǎn)物a與BSA混合液的熒光發(fā)射光譜[8]。

2 實(shí)驗(yàn)分析與結(jié)果

2.1 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

去甲去氫斑蝥素(1)，收率66.7%，m. p.117.4～119.3 ℃。1H NMR ((CH3)2CO-d6，600 MHz)，δ：6.62(d，2H，J=0.6 Hz，CH=CH)；5.28(s，2H，HCOCH)；3.20(s，2H，HCCH)，去甲去氫斑蝥素(1)的熔點(diǎn)、氫譜與參考文獻(xiàn)[3]相符合。N-氨基去甲去氫斑蝥素酰亞胺(2)為白色固體，m.p.137.3 ～ 139.4 ℃(文獻(xiàn)值[9]為139 ～ 140.5 ℃)。對氟苯甲醛縮氨代去甲去氫斑蝥素白色晶體，產(chǎn)率43%。m.p.156.5～157.8 ℃。1H NMR ((CH3)2CO-d6，600 MHz)，δ：9.06(s，1H，N=CH)；7.97(s，2H，Ar-H)；7.28(s，2H，Ar-H)；6.64(d，2H，J=9.6 Hz，CH=CH)；5.25(s，2H，HCOCH)；3.14 (s，2H，HCCH)。13C NMR((CH3)2CO-d6，150 MHz)，δ：48.48，79.15，115.92，129.99，130.74，136.33，160.54，164.15，173.09。

2.2 目標(biāo)產(chǎn)物與BSA的猝滅機(jī)理

2.2.1 熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)分子中主要有苯丙氨酸、色氨酸等一系列殘基產(chǎn)生的內(nèi)源熒光，在波長為286 nm光的激發(fā)作用下，340 nm左右會出現(xiàn)色氨酸殘基產(chǎn)生的熒光發(fā)射峰。實(shí)驗(yàn)中，固定BSA濃度不變，加入相同濃度不同體積的對氟苯甲醛去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮溶液進(jìn)行熒光檢測，可得到熒光猝滅譜圖。由圖2可以看出，隨著藥物濃度的增大，BSA的最大熒光強(qiáng)度有一定規(guī)律變化，其變化為隨著濃度的增大而減小，說明去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮對氟苯甲醛對BSA有猝滅作用。

1～7：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0(C(a) =5)圖2 產(chǎn)物對BSA的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of product-BSA

2.2.2 猝滅機(jī)理與常數(shù)

藥物對BSA的猝滅作用分為動態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅。對動態(tài)猝滅，溫度升高，基態(tài)復(fù)合物穩(wěn)定性減小，猝滅常數(shù)也隨之減?。粚o態(tài)猝滅，隨著溫度的增高，猝滅常數(shù)增大。藥物對BSA的作用過程遵循Stern-Volmer方程：

F0/F=1+KqT0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式(1)中，Ksv是猝滅常數(shù)；F0是BSA溶液的熒光強(qiáng)度；F是加入藥品后BSA溶液的熒光強(qiáng)度；Kq是雙分子猝滅的速率常數(shù)；[Q]是猝滅劑Q的濃度；T0是猝滅劑不存在時(shí)熒光分子的平均壽命，約等于10-8s。根據(jù)方程式(1)，作去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮對氟苯甲醛對BSA猝滅的Stern-Volmer曲線(圖3)，直線斜率為猝滅常數(shù)。由圖3可知，290、300和310 K的Ksv分別為3.08×104L/mol(R=0.9979)、3.73×104L/mol(R=0.9918)、3.92×104L/mol(R=0.9948)。隨著溫度的升高，BSA的猝滅常數(shù)升高，可以推出該過程是動態(tài)猝滅。可以根據(jù)Ksv= KqT0計(jì)算出相應(yīng)的Kq等于3.08×1012、3.73×1012、3.92×1012L/(mol·s)。Kq值均大于生物分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L/(mol·s),這可以得出目標(biāo)產(chǎn)物對BSA的熒光猝滅作用包含了靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩類。

圖3 目標(biāo)產(chǎn)物與BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線Fig.3 The Stern-volmer curves of fluorescence of BSA quenching by target products

2.2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

目標(biāo)產(chǎn)物對BSA存在靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，由此我們可以用靜態(tài)猝滅公式(2)計(jì)算其結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：

Lg[(F0-F)/F]=KA-nLg [Q]

(2)

[(F0-F)/F]對 [Q]作圖(圖4)，由圖中的截距可以求DNCT與BSA的KA值，直線斜率可以算出兩者的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果如表1所示。

圖4 不同溫度下產(chǎn)物對BSA的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curves of the product-BSA at different temperatures

表1 產(chǎn)物與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Tab.1 The binding constant and binding points for the system of product -BSA

2.2.4 相互作用力

分子之間的主要作用力有范德華力、疏水作用力、靜電引力等。Ross的判斷規(guī)則如下：當(dāng)Δ S<0，ΔH<0，主要表現(xiàn)為范德華力；當(dāng)ΔS>0，ΔH>0，主要表現(xiàn)為疏水作用力；當(dāng)ΔS>0，ΔH<0，主要表現(xiàn)為靜電作用力。當(dāng)溫度變化范圍很小時(shí)，我們可以把熒光猝滅進(jìn)程中的ΔH看為常數(shù)，根據(jù)下面的三個(gè)方程式計(jì)算出ΔH、ΔS，由此就可以判斷產(chǎn)物與牛血清蛋白的作用力類型。

ΔG=-RTlnK

(3)

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

根據(jù)290、300、310 K三個(gè)溫度下計(jì)算出的結(jié)合常數(shù)，我們可以計(jì)算出目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白的相互作用的熱力函數(shù)值，值見表2。根據(jù)表中的值可以得出目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白之間是通過疏水作用力而結(jié)合在一起的，并且ΔG<0我們可以得出他們之間是吸熱熵增加的自發(fā)過程。

表2 目標(biāo)產(chǎn)物和BSA的熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Thermodynamic parameters of BSA- product

2.3 同步熒光分析

因?yàn)榘被釟埢淖畲蟛ㄩL容易受到微環(huán)境的影響，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步利用同步熒光光譜分析其分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。固定波長差分別為Δλ=15 nm與Δλ=60 nm的同步熒光能分別體現(xiàn)酪氨酸殘基和色氨酸殘基的構(gòu)象變化。有圖5可知，當(dāng)隨著藥物濃度增加，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的均產(chǎn)生熒光猝滅，但Δλ=60 nm色氨酸殘基的最大發(fā)射波長略有紅移，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。

圖5 同步熒光光譜Fig.5 Synchronocs fluorescenee speetra

3 結(jié)論

本文合成了對氟苯甲醛縮去甲去氫斑蝥素酰亞胺，并且通過熒光光譜法研究了其與牛血清蛋白之間的相互作用。研究表明，目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白之間存在兩種猝滅作用即靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅。在290、300和310 K溫度下，目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為3.37×104，2.7×104，2.69×104L/mol和0.947,1.16,1.20；并且它們之間是通過疏水結(jié)合力結(jié)合在一起。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為該類藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸、分布和藥物活性提供一些參考價(jià)值。

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