河南煙草鐮刀菌的分子鑒定及致病性分析

邱睿，白靜科，李成軍，李淑君，李小杰，陳玉國，胡亞靜，劉東升

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省許昌市永昌大道與青梅路交叉口 461000

鐮刀菌（Fusariumspp.）是一類世界性分布的真菌，可以侵染多種植物，引起植物的根腐、莖腐、花腐和穗腐等多種病害。鐮刀菌侵染煙草引起的枯萎病和根腐病是世界性的土傳真菌病害，在美國、韓國、加拿大、澳大利亞、南非、日本等產(chǎn)煙國普遍發(fā)生[1-3]。近兩年鐮刀菌根腐病在我國煙區(qū)的發(fā)病范圍和發(fā)病程度呈上升趨勢(shì)，目前在云南、河南、湖南、山東、貴州、福建、湖北、安徽等地均有發(fā)生[4-11]，重病煙田發(fā)病率達(dá)30%以上[4]。目前，國內(nèi)外學(xué)者在鐮刀菌的分類地位與寄主范圍、形態(tài)學(xué)與分子特征、致病機(jī)理等方面均有報(bào)道[12-16]。河南省煙草鐮刀菌根腐病已有報(bào)道[4]，但有關(guān)不同生態(tài)區(qū)域鐮刀菌類型、主要致病菌種類鑒定、菌株致病力的差異及病原菌侵染煙草引起病害的發(fā)生、流行規(guī)律等均缺乏系統(tǒng)性研究。而明確病原菌的種類及其致病力是指導(dǎo)煙草鐮刀菌根腐病防治的基礎(chǔ)。rDNA-ITS序列分析可有效彌

補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的局限性，目前主要依據(jù)結(jié)合培養(yǎng)條件的形態(tài)學(xué)鑒定和真菌18S rDNA的ITS區(qū)序列分析解決病原鐮刀菌菌種的分類地位[17-18]。因此，本試驗(yàn)選擇河南省煙區(qū)為切入點(diǎn)，在河南省各大煙區(qū)煙草根際土壤中及發(fā)病煙株上分離純化疑似煙草鐮刀菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)鑒定、致病性測(cè)定與rDNA-ITS序列測(cè)定及分析，旨在明確該病在河南煙區(qū)的基本分布及各煙區(qū)主要致病菌種類，為今后各煙區(qū)防治該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

2016—2017年，選擇河南省豫南、豫東、豫中和豫西4個(gè)生態(tài)區(qū)的12個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)，每個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)選擇不同區(qū)域、不同田塊類型的烤煙煙田，在煙草團(tuán)棵期、旺長期和成熟期分別進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查和普查，每個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)選擇不同生長期根莖類病害發(fā)病較重的9塊煙田，取具有典型癥狀的病株5～10株，截取莖基部與發(fā)病根系，同時(shí)在每塊煙田按5點(diǎn)取樣法采取土樣（見表1），由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究室進(jìn)行相關(guān)病原菌的分離與鑒定。

表1 采集樣品信息Tab.1 Sample information

1.1.2 試劑和儀器

Taq PCR MasterMix(Cat#KT201-02)購 于TIANGEN公司，通用引物ITS1和ITS4由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供，BIO-RAD PCR儀(美國BIO-RAD公司)，Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離

（1）組織分離法。參照文獻(xiàn)[19]的方法對(duì)病原菌進(jìn)行分離。在樣品病健交界處切取適當(dāng)大小的組織塊，用75%酒精消毒30 s，15%次氯酸鈉消毒2 min，再用無菌水清洗3次。無菌吸水紙吸干組織塊表面水分后直接接種于含25%乳酸的PDA培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，待組織塊周圍長出菌落后，挑取邊緣菌落進(jìn)行純化[11]。依據(jù)純化后的菌落特征分類編號(hào)，保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）土壤分離法。參照文獻(xiàn)[20]的方法對(duì)煙田土壤真菌進(jìn)行分離。稱取混合均勻的土壤1.0 g，放入帶有玻璃珠的100 mL三角瓶中，加99 mL無菌水，置搖床震蕩10 min使土樣均勻分散在稀釋液中成為10-2土壤懸浮液，將土壤懸浮液繼續(xù)稀釋成10-3稀釋液后涂布于含25%乳酸的PDA培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑取具有鐮刀菌特征的菌落進(jìn)行純化[11]。依據(jù)純化后的菌落特征分類編號(hào)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3～4 d的菌株，用打孔器打成直徑約4 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，25℃恒溫培養(yǎng),觀察菌落顏色及形態(tài)變化。挑取培養(yǎng)菌絲制作臨時(shí)水玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞、子實(shí)體的形態(tài)特征，依據(jù)Booth分類系統(tǒng)對(duì)鐮刀菌進(jìn)行分類鑒定[21]。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

刮取培養(yǎng)基5～7 d的菌絲體50 mg，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA，提取后的DNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用通用引物ITS1和ITS4對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 體 系（25 μL）：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μL/L 的引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，用 ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 mim，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察到合適大小條帶后，將所對(duì)應(yīng)的原始擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL送往生工生物工程股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用 MAGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 病原菌致病性測(cè)定

目前還沒有感煙草鐮刀菌的鑒別寄主相關(guān)報(bào)道，本研究選用河南煙區(qū)主栽品種中煙100測(cè)定病原菌的致病性。煙苗在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室大棚培育至4葉期。將致病性鑒定的分離物在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，從菌落邊緣取新鮮的菌絲塊，分別接種于麥粒培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d，制成麥粒帶菌培養(yǎng)物[22]。接種煙株前，先將滅菌花盆里裝一半滅菌土，再將麥粒帶菌培養(yǎng)物（每缽接15粒）拌入5 cm左右的表層土中，施足水后在28℃下保濕培養(yǎng)4 d，再移入苗床期健壯的煙苗。將接種的煙苗置于28～30℃人工氣候室中保濕培養(yǎng)，拌入無菌麥粒培養(yǎng)物的煙苗為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，觀察發(fā)病狀況。對(duì)發(fā)病煙苗采用組織分離法重新分離，鏡檢觀察分離物，完成柯赫氏法則驗(yàn)證[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮刀菌菌株的分離

2016—2017年，從河南省豫南、豫東、豫中和豫西4個(gè)生態(tài)區(qū)的12個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)，采集典型煙草鐮刀菌根腐病病株222株及土壤樣品108份，分離獲得鐮刀菌，采用單孢分離法進(jìn)行純化，共獲得純培養(yǎng)菌株98株，其中50株分離自病株，48株分離自土壤。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

根據(jù)菌株菌落、菌絲、分生孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞、子實(shí)體等的形態(tài)特征及大小，依據(jù)Booth分類系統(tǒng)對(duì)純化菌株進(jìn)行分類鑒定，初步將98個(gè)菌株分為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、木 賊 鐮 刀 菌（Fusarium equiseti） 和Fusarium nematophilum5組。

菌株1-80號(hào)為尖孢鐮刀菌，在PDA培養(yǎng)基上菌落多為白色和粉白色，表面產(chǎn)生大量孢子粉，后期菌落產(chǎn)生橙、紫、深藍(lán)或黑色色素，菌絲致密，部分菌落背面可見明顯輪紋；在顯微鏡下可觀察到兩種類型的分生孢子，小型分生孢子數(shù)量多、卵圓形，多無分隔，5～12 μm×3～3.5 μm；大型分生孢子紡錘形，頂端鉤狀，基部有足細(xì)胞，23～53 μm×2.7～5.5 μm（圖1A、A’）。菌株81-90號(hào)為茄病鐮刀菌，在PDA培養(yǎng)基上菌落為白色，表面產(chǎn)生肉粉色粉孢子團(tuán)，呈環(huán)狀排列；在顯微鏡下小型分生孢子腎形、橢圓形和卵形，無分隔，5.4～17.7 μm×1.4～4.5 μm，大型分生孢子量多、馬特形，頂部鈍圓，3～5隔膜，34.4～ 50.4 μm×4.3～ 5.8 μm（ 圖 1B、B’）。 菌 株91-95號(hào)為層出鐮刀菌，在PDA培養(yǎng)基上為初為白色，后為紫紅色，氣生菌絲白色、濃密，可形成藍(lán)黑色菌核；在顯微鏡下小型分生孢子卵狀，0～1隔膜，5.7～13.9 μm×2.4～4.8 μm，大型分生孢子呈鐮刀形，較直、頂孢較尖，足孢明顯，3～5隔膜，20.6～49.0μm×2.3～4.9 μm（圖1C、C’）。菌株96、97號(hào)為木賊鐮刀菌，在PDA培養(yǎng)基上菌落白色，菌絲中間致密周圍稀疏，菌落正面產(chǎn)生黃色孢子粉；在顯微鏡下觀察，其小型分生孢子卵圓形，5～12 μm×2～3.5 μm，大型分生孢子紡錘形，中部顯著膨大，基部有足細(xì)胞，3-5個(gè)分隔，23～53 μm×2.5～5.5 μm（圖1D、D’）。菌株98號(hào)為Fusarium nematophilum，在PDA培養(yǎng)基上菌落白色，菌絲致密，菌絲表面呈現(xiàn)連續(xù)環(huán)紋；在顯微鏡下觀察僅見大型分生孢子，鐮刀形，3～5個(gè)分隔，83～115 μm×2.5～5.5 μm（圖1E、E’）。

圖1 分離鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Fusarium spp. on PDA medium

2.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

通過真菌ITS1和ITS4通用引物對(duì)分離純化的98個(gè)株菌株進(jìn)行rDNA-ITS序列測(cè)定，獲得有效序列長度為493～567 bp。將98個(gè)DNA序列與GenBank中已登錄的鐮刀菌序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明， 1-80號(hào)菌株的rDNA-ITS序列與數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)為KX421442.1尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99%以上，分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，從而鑒定菌株1-80號(hào)為尖孢鐮刀菌；81-90號(hào)菌株rDNA-ITS序列與GenBank中KY617036.1茄病鐮刀菌（F. solani）序列同源性為100%，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，說明81-90號(hào)菌株為茄病鐮刀菌；91-95號(hào)菌株序列與數(shù)據(jù)庫中KY425734.1層出鐮刀菌（F. proliferafum）序列同源性在93%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將這5個(gè)菌株鑒定為層出鐮刀菌；96、97號(hào)菌株的rDNA-ITS序列與GenBank中KJ412501.1木賊鐮刀菌（F. equiseti）的親緣關(guān)系最近，同源性為99%，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，從而確定97、98號(hào)菌株為木賊鐮刀菌；98號(hào)菌株的rDNA-ITS序列與GenBank中KY617040.1F. nematophilumMHE 9 MC菌株序列同源性最高（99%），表明98號(hào)菌株為F. nematophilum。

圖2 部分菌株rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of partial strains rDNA-ITS sequence

2.4 病原菌致病性分析

煙苗接種病原菌7 d后觀察煙苗發(fā)病情況，供試的98個(gè)菌株中，48個(gè)菌株處理的煙苗出現(xiàn)典型病癥：病株葉片由下向上逐步變黃、皺縮枯萎；病株根莖部呈不同程度腐爛，須根明顯減少，對(duì)照煙苗均未發(fā)病且生長良好（圖3）。對(duì)發(fā)病煙苗進(jìn)行病原物分離、純化，鏡檢觀察獲得的純培養(yǎng)物，其形態(tài)與接種的病原菌相同，證明所分離到的鐮刀菌菌株具有致病性。在引起煙株發(fā)病的48個(gè)鐮刀菌分離物中，尖孢鐮刀菌39株、茄病鐮刀菌5株、層出鐮刀菌3株、木賊鐮刀菌1株，其中36個(gè)菌株分離自病株，占75%，12個(gè)菌株分離自土壤，占25%。豫南致病性鐮刀菌包括尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和木賊鐮刀菌，以尖孢鐮刀菌為主；豫中為尖孢鐮刀菌；豫東、豫西為茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌。

圖3 病原菌致病性測(cè)定Fig.3 Pathogenicity determination of the Fusarium isolate

3 討論

鐮刀菌根腐病是一種重要的土傳根莖類病害，田艷艷等[4]認(rèn)為引起河南省煙草枯萎病與根腐病的優(yōu)勢(shì)病原種群是尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌。本研究通過病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察、病原菌rDNA-ITS序列分析及致病性測(cè)定，認(rèn)為河南省煙草鐮刀菌根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、層出鐮刀菌和木賊鐮刀菌，其中木賊鐮刀菌侵染煙草在河南為首次報(bào)道。48種致病性病原菌中尖孢鐮刀菌占81.25%，為引起全省煙草鐮刀菌根腐病的優(yōu)勢(shì)致病菌，這與陳高航[9]報(bào)道的湖北省恩施煙草主產(chǎn)區(qū)煙草根腐病致病菌是尖孢鐮刀菌的結(jié)果相符，與桑維鈞等[7]研究認(rèn)為茄病鐮刀菌是貴州省煙草根腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌的結(jié)論存在差異。研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌根腐病致病性菌種種類和致病力差異與植物所生存的生態(tài)條件及植物本身抗感性等條件密切相關(guān)[9]。貴州煙田微生態(tài)環(huán)境及主栽煙草品種與河南省存在差異，可能導(dǎo)致兩省煙草根腐病的主要致病菌不同；田艷艷等分析待測(cè)菌株致病性所使用的煙草品種是小黃金1025，本研究用到的煙苗是中煙100，可能兩種煙草品種對(duì)不同鐮刀菌的抗感性不同，從而導(dǎo)致致病性測(cè)定結(jié)果的差異，且本研究測(cè)定鐮刀菌的致病性所使用的煙草品種是目前生產(chǎn)中的主栽品種，切合實(shí)際，對(duì)生產(chǎn)更具指導(dǎo)意義。在測(cè)定菌株致病性時(shí)，陳高航[9]、田艷艷等[4]通過劃傷煙苗根莖部，為待測(cè)菌人為制造入侵點(diǎn)，其結(jié)果會(huì)造成假陽性，本研究通過無創(chuàng)接種法，菌株自行尋找宿主入侵，貼近自然環(huán)境發(fā)病情況，試驗(yàn)數(shù)據(jù)更可靠。本研究共分離純化出98株鐮刀菌，在本實(shí)驗(yàn)條件下只有48株在中煙100上有致病性，其余50個(gè)菌株無致病性的原因可能是菌株本身不致病，或是煙株發(fā)病慢、癥狀不明顯，也可能是中煙100對(duì)菌株有抗性，但目前還沒有感煙草鐮刀菌的鑒別寄主相關(guān)報(bào)道，純化鐮刀菌菌株對(duì)不同煙草品種的致病性有待進(jìn)一步深入研究。

本研究分離純化出的木賊鐮刀菌經(jīng)致病性測(cè)定能夠侵染煙草品種100，這一結(jié)果與桑維鈞等[7]的測(cè)試結(jié)果一致。該病原菌還可以引起小扁豆根腐病[23]、苜蓿根莖腐爛病[24]等，但不同煙草品種對(duì)木賊鐮刀菌的抗感性及其致病性的強(qiáng)、弱有待進(jìn)一步測(cè)定。

4 結(jié)論

明確不同煙區(qū)煙草鐮刀菌根腐病的主要致病菌，對(duì)有效控制煙區(qū)病害的發(fā)生具有重要意義。本研究通過對(duì)河南省不同煙葉產(chǎn)區(qū)烤煙根腐病病原菌進(jìn)行分離純化、鑒定和致病性分析，確定尖孢鐮刀菌為全省煙區(qū)重點(diǎn)防控對(duì)象，豫南煙區(qū)還需加強(qiáng)層出鐮刀菌和木賊鐮刀菌的防控，豫東、豫西需監(jiān)測(cè)茄病鐮刀菌的發(fā)生及防治。

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