鯉浮腫病研究進(jìn)展

呂曉楠，徐立蒲，王 姝，王靜波，王小亮，曹 歡，張 文，潘 勇，江育林

（北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176）

鯉是全球養(yǎng)殖最廣泛的魚類，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的品種之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年我國鯉養(yǎng)殖產(chǎn)量350萬噸，占淡水魚類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的12.4%[1]。錦鯉是鯉的變種，在歐洲、日本和我國同樣具有重要市場價(jià)值[2-3]。錦鯉皰疹病毒?。↘oi Herpersvirus Disease，KHVD）、鯉春病毒血癥（spring viremia of carp，SVC）以及鯉浮腫?。–arp edema virus disease，CEVD；或稱錦鯉昏睡病，Koi sleepy disease，KSD）是目前鯉和錦鯉的3種重要病毒病，給世界各國鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前SVC和KHVD已有較多研究報(bào)道，在我國2016年的陽性檢出率分別為9.3%和1.8%[4]。2016年我國首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)鯉浮腫病毒（CEV）[3，5]，近兩年我國河南、河北和云南等多個(gè)省份檢出CEV，CEV在我國的流行情況和經(jīng)濟(jì)損失情況比SVC和KHVD嚴(yán)重，河南省每年由CEV導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到5 000萬元[6-9]，亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心（NACA）于2017年將CEV列入亞太區(qū)域水生動(dòng)物疫病監(jiān)測名錄[10]。本文就國內(nèi)外對CEV的病原生物學(xué)特征、引起的臨床癥狀、流行特點(diǎn)、檢測技術(shù)及防控等內(nèi)容的研究進(jìn)行了綜述，旨在為該病的預(yù)防與控制提供參考。

1 病原生物學(xué)特征

CEV屬于痘病毒科（Poxviridae），是線性雙鏈DNA（dsDNA）病毒。目前已知痘病毒科分為脊椎動(dòng)物痘病毒亞科和昆蟲痘病毒亞科2個(gè)亞科[11]。而CEV屬于未定亞科的痘病毒，大小約為200 nm×400 nm[3]。痘病毒雖是DNA病毒，但其增殖過程全部在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行[12-13]。通過透射電鏡觀察，CEV在鰓的上皮細(xì)胞胞漿中，表面平整，呈圓形或卵圓形；衣殼蛋白均勻覆蓋在腎樣病毒核心周圍。CEV在電鏡下也可呈類似桑葚形，并有囊膜[13-15]。

2 臨床癥狀

感染CEV的鯉或錦鯉行動(dòng)遲緩，常聚集在池塘的水面或邊緣處[3，16]，或靜置在池塘中，或在池底不動(dòng)，倒向一側(cè)，呈沉睡狀態(tài)。當(dāng)受到觸動(dòng)時(shí)，病魚會(huì)游動(dòng)，但很快又繼續(xù)處于昏睡狀態(tài)[3，7，15，17]。病魚臨床表現(xiàn)為爛鰓、體表糜爛、出血、皮下組織水腫、眼球凹陷、食欲不振、吻端和鰭的基部潰瘍等[1-2，9，15，18-19]。

在感染CEV的鯉或錦鯉中，最常見癥狀是包括爛鰓在內(nèi)的鰓絲損害癥狀。低倍鏡觀察發(fā)現(xiàn)，鰓組織上皮細(xì)胞的過度增殖導(dǎo)致了鰓絲腫脹[13，15，20]；高倍鏡下表現(xiàn)出鰓細(xì)胞水腫、重度增生、鰓小片相互融合以及上皮細(xì)胞脫落[2]。鰓絲末端細(xì)胞增生會(huì)嚴(yán)重影響到血液的氣體交換，導(dǎo)致魚出現(xiàn)缺氧、浮頭、反應(yīng)遲緩和代謝紊亂等現(xiàn)象，因而推測鰓組織的病理變化可能是導(dǎo)致魚最終缺氧死亡的主要原因[15]。通過qPCR已證實(shí)，鰓組織CEV的病毒載量顯著高于腎、脾、表皮和腸腔等組織[7，19，21]。

CEV與KHV感染均具有爛鰓和眼凹陷等相似癥狀，且僅導(dǎo)致鯉或錦鯉發(fā)病死亡，因而養(yǎng)殖者經(jīng)常把CEV感染誤認(rèn)成KHV[6]。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，當(dāng)鯉或錦鯉出現(xiàn)爛鰓等癥狀且死亡率高時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行KHV和CEV的PCR或qPCR檢測，以確定病原。此外，CEV拷貝量與臨床癥狀、發(fā)病死亡情況不一定成正比[1，10，22-23]。

3 流行特點(diǎn)

3.1 易感品種

鯉和錦鯉的不同品種對CEV易感程度不同。研究表明，不同品系鯉感染CEV后表現(xiàn)出不同臨床癥狀，其中錦鯉和捷克地方鯉（P?erov scaly carp，PS）臨床癥狀最為明顯，而黑龍江野鯉（Amur wild carp，AS）對CEV最不易感[21]。目前在我國養(yǎng)殖的錦鯉和松浦鏡鯉均已檢出CEV[5-7]。其他品系鯉對CEV的敏感程度尚不清楚，需要進(jìn)一步開展流行病學(xué)調(diào)查和研究工作。

3.2 發(fā)病的環(huán)境條件

Miyazaki等[15]認(rèn)為水溫是影響CEV的重要環(huán)境因子。研究發(fā)現(xiàn)，在15～25 ℃水溫下錦鯉感染CEV后發(fā)病，幼魚的累積死亡率可高達(dá)75%～100%。在較高溫度下，最初魚表現(xiàn)昏睡，2～3 d后出現(xiàn)大量死亡[2，14-15，19]。在較低水溫（6～10 ℃）下，CEV感染病程較長且死亡率較低[3，20]。據(jù)現(xiàn)場調(diào)查，我國河南等地的CEV發(fā)病時(shí)間有2個(gè)高峰，分別是5—6月和9月[6]。這2個(gè)季節(jié)水溫一般在20～27 ℃，推測這可能是我國CEV傳播的最適水溫，但有待進(jìn)一步研究確定。綜合國內(nèi)外資料，CEV在6～27℃水溫范圍內(nèi)均有檢出，發(fā)病溫度范圍較寬，提示水溫可能并不是該病暴發(fā)的關(guān)鍵因素。

3.3 傳播方式

未感染的鯉與已感染CEV的錦鯉同居6 h后可檢測到CEV，證實(shí)病毒可以在錦鯉和鯉之間水平傳播，感染7 d后鯉開始出現(xiàn)典型癥狀和死亡[24]。帶病苗種流通以及展覽比賽等是CEV快速大范圍傳播的主要原因[25]。CEV是否存在垂直傳播途徑還有待證實(shí)。

3.4 分布范圍

1974年，日本首次在新瀉縣錦鯉中發(fā)現(xiàn)CEV，之后在廣島市和琦玉縣等地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)CEV報(bào)道[13，26-30]。由于該病很長一段時(shí)間以來只在日本流行，因此各國對CEV重視不夠，有關(guān)其疫情報(bào)道很少。但近年來CEV報(bào)道病例迅速增加（表1），荷蘭還從已經(jīng)歸檔的2004年樣品中檢出CEV[18，24]，推測CEV在上述地區(qū)早有發(fā)生，但當(dāng)時(shí)由于各種原因未得到有效確認(rèn)。

2014年7月，北京市房山區(qū)某養(yǎng)殖場錦鯉幼魚暴發(fā)疫病，死亡率約80%。病魚出現(xiàn)爛鰓、體浮腫等臨床癥狀，后確診為CEV感染。這是我國首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)CEV感染[3]。經(jīng)調(diào)查2017年對河南省養(yǎng)殖鯉（包括錦鯉）造成重大危害的“鯉急性爛鰓病”主要病原為CEV[6]。2017年本實(shí)驗(yàn)室對全國9個(gè)省市的97家鯉和錦鯉養(yǎng)殖場進(jìn)行了CEV檢測，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場陽性率為52%。2013—2015年波蘭監(jiān)測的36個(gè)鯉和錦鯉養(yǎng)殖場中有16個(gè)場檢出CEV，場陽性率為45%[23]，與我國CEV陽性率接近。由此可見，CEV在國內(nèi)外分布較廣，對我國鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)具有重大危害。

表1 CEV流行情況調(diào)查匯總

4 分子流行病學(xué)

現(xiàn)階段對CEV的結(jié)構(gòu)基因組尚不可知，只有部分基因編碼序列P4a用于分子流行病學(xué)研究。通過對已經(jīng)公布的CEV 4a核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，CEV各毒株間的突變率高于6 %[20，23]，提示CEV存在至少2個(gè)，甚至3個(gè)基因組或譜系。Matras等[23]把目前發(fā)表的P4a基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，將CEV劃分為I和II 2個(gè)基因型，其中II基因型又分為IIa和IIb基因型。研究表明，CEV基因型與宿主種類有明顯關(guān)系，即IIa基因型主要感染錦鯉和鯉，而I和IIb基因型僅分離于鯉[1，7，36]。目前我國各地檢出的CEV毒株主要屬于IIa基因型[1，7]。

5 檢測方法

5.1 取樣部位與取樣時(shí)間

由于鰓組織為CEV的主要靶器官[7，19，21]，在檢測CEV時(shí)應(yīng)單獨(dú)取鰓組織，制樣檢測。調(diào)查表明，CEVD一般持續(xù)發(fā)病7～10 d，之后再取樣檢測常為陰性。本實(shí)驗(yàn)室人工感染試驗(yàn)也證實(shí)，在發(fā)病和死亡停止后魚體內(nèi)的病毒量逐漸降低到0，提示魚可能對CEV產(chǎn)生了免疫力。因此在CEV監(jiān)測時(shí)，最好抽取正在發(fā)病的魚或尚未發(fā)病的魚；如果取到病愈的魚，極易得到假陰性結(jié)果，從而造成漏檢。

5.2 檢測方法

5.2.1 光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察 由于CEV感染所致的鰓組織病理變化與感染KHV、細(xì)菌或寄生蟲發(fā)生的病理變化相似，不具有特異性，因此僅能作為疑似病例判定依據(jù)。電鏡觀察鰓組織中成熟病毒粒子也是一種檢測方法，但由于電鏡設(shè)備昂貴、制樣和觀察需要較高技術(shù)等限制，目前該方法僅適用于首次病例的發(fā)現(xiàn)或科研。

5.2.2 病毒分離 截至目前仍沒有篩選到能易感CEV 的細(xì)胞系[3，3，16，19]。有研究發(fā)現(xiàn)，CEV 能夠在鰓來源的原代細(xì)胞中復(fù)制[21]。因此，急需構(gòu)建對CEV敏感的細(xì)胞系，以此作為CEV檢測和深入研究的突破口。

5.2.3 分子生物學(xué)檢測方法 PCR檢測技術(shù)是CEV的主要檢測手段。Oyamatsu[37]設(shè)計(jì)的套式引物從具有CEVD癥狀的錦鯉樣品中檢出CEV，但后續(xù)發(fā)現(xiàn)此方法存在漏檢情況[1，22-23，36]。英國環(huán)境、漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)中心（Centre for environment，fisheries and aquaculture science，CEFAS）設(shè)計(jì)了另一套式PCR和qPCR的引物[23]。其中，套式PCR依然存在漏檢情況，而qPCR是目前較適合開展監(jiān)測的技術(shù)方法[1，36]。qPCR和傳統(tǒng)的套式PCR具有相似檢測靈敏度，其組織檢出限為1～10 copies/反應(yīng)或4～40 copies/mg[25]。曹歡等[38]建立了CEV的LAMP檢測方法，最低可檢出6 copies/μL，具有較高的特異性和檢測靈敏度。Soliman等[39]采用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase polymerase ampli fi cation，RPA），建立了快速鑒別診斷鯉和錦鯉CEV和KHV的新方法，其最低檢出限與PCR檢測方法相似。

5.2.4 CEVD診斷 對CEVD的診斷，應(yīng)采用流行特點(diǎn)、臨床癥狀以及分子生物學(xué)檢測相結(jié)合的方法，即當(dāng)同池魚僅鯉或錦鯉發(fā)病死亡，有爛鰓、凹眼和昏睡等癥狀時(shí)，qPCR或套式PCR或LAMP檢測CEV陽性時(shí)，可判定為CEV感染。

6 預(yù)防和控制措施

6.1 抗病育種

感染實(shí)驗(yàn)表明，AS對CEV感染表現(xiàn)出較強(qiáng)抵抗力且無明顯CEV感染癥狀[21]，提示可通過培育或引進(jìn)抗病品種，選育對CEV不易感的品種，以減少CEV感染風(fēng)險(xiǎn)。

6.2 監(jiān)測、檢疫和隔離

苗種帶毒擴(kuò)散是許多地區(qū)CEV流行蔓延的一個(gè)主要因素，因此在引入苗種時(shí)需進(jìn)行嚴(yán)格的隔離檢疫，在15～25 ℃至少進(jìn)行30 d[25]。錦鯉展會(huì)也會(huì)增加疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，建議參展錦鯉隔離養(yǎng)殖，避免通過混養(yǎng)造成CEV廣泛傳播，運(yùn)回的參展錦鯉也需要隔離[37]。對養(yǎng)殖場，尤其是苗種場定期開展CEV監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)陽性需及時(shí)處置。

6.3 應(yīng)急措施

目前對CEVD沒有有效治療措施。日本學(xué)者建議對已出現(xiàn)CEVD臨床癥狀的鯉或錦鯉進(jìn)行0.5%濃度的鹽浴，但這并不能根除CEV[15，40]。在0.5%鹽水中鯉應(yīng)激反應(yīng)較低，CEV增殖能力減弱[15]。對于已經(jīng)確認(rèn)發(fā)生CEVD的養(yǎng)殖場，不要采取濫用藥物、換水或加藥調(diào)水、倒池等引起應(yīng)激反應(yīng)的措施，應(yīng)及時(shí)撈取死魚，注意增氧，停止投喂餌料。一般CEVD發(fā)病 7～10 d 后，死亡現(xiàn)象會(huì)自然停止[3，1，6-7]。

6.4 預(yù)防

CEVD發(fā)病前養(yǎng)殖場普遍存在換水、倒池、水質(zhì)突變、天氣突變和魚藥使用等情況，有的養(yǎng)殖場在發(fā)病后濫用各種魚藥，導(dǎo)致魚進(jìn)一步大規(guī)模死亡，而在發(fā)病后不用或少用藥的養(yǎng)殖場，魚死亡率反而較低[3，9，5-6]。因此，養(yǎng)殖場應(yīng)提高養(yǎng)殖管理水平，發(fā)病前后避免濫用藥，減少魚體應(yīng)激。這也是防控CEVD和降低損失的有效措施。

7 展望

目前對CEV的易感宿主、流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)制等認(rèn)識(shí)尚淺，使得CEV對我國水生動(dòng)物的影響很難得到準(zhǔn)確評估。對CEV基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的功能、抗原性、敏感細(xì)胞系的建立等基礎(chǔ)研究方面也還存在許多空白。而這些領(lǐng)域的研究進(jìn)展有助于病毒分離純化、檢測技術(shù)優(yōu)化等，以及深入研究工作。

CEV的檢測尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，需盡快建立特異、敏感、快速、適宜現(xiàn)場診斷的方法，盡快構(gòu)建敏感細(xì)胞系。目前對于CEV還沒有特效預(yù)防藥物，因此研制高效CEV疫苗已成為亟待解決的問題。

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