人源非小細(xì)胞肺癌異種移植模型的建立和鑒定

錢麗萍, 余 飛, 瞿葉清, 翟青新, 王玉娟, 方 天

(1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院, 南京 210008; 2. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院, 南京 210008)

按組織學(xué)分類肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC), NSCLC又可大致分為鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell cancer, SCC)、腺癌(lung adenocarcinoma cancer, LAC)和大細(xì)胞癌。肺癌是目前全世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤, 致死率高，2012年全球新發(fā)病例一億八千萬, 約占全球腫瘤總數(shù)的12.9%[1,2],其中NSCLC占肺癌總?cè)藬?shù)的85%左右[3], 五年生存期的患者比例是16.6%[4]。赫捷等[5]關(guān)于中國癌癥數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，肺癌居我國癌癥死亡首位,且在男女人群中均是如此。因此，尋找更優(yōu)化的個(gè)體治療方案，是精準(zhǔn)醫(yī)療模式下的首要命題。而在當(dāng)下個(gè)體化治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的背景下，構(gòu)建新的腫瘤臨床前模型顯得極為重要。

患者來源的移植瘤模型(patient-derived xenografts, PDXs)因更具臨床應(yīng)用價(jià)值而越來越受到人們青睞[6]。1990 年代就有應(yīng)用肺癌 PDX模型來進(jìn)行細(xì)胞毒性藥物的研究， 其結(jié)果顯示細(xì)胞毒性藥物的臨床患者療效與來源于這些患者的 PDX 模型對(duì)于此藥的反應(yīng)非常一致[7]。同樣，在兒童橫紋肌肉瘤中也有類似結(jié)果的報(bào)道[8]。近年來，由于藥物研發(fā)中遇到一些難以突破的瓶頸，人們又開始重新對(duì)構(gòu)建不同腫瘤類型的 PDX 模型產(chǎn)生濃厚興趣[9]。這些模型正成為腫瘤生物學(xué)研究及抗腫瘤藥物研發(fā)過程中相比其他模型更受歡迎的臨床前模型[10-12]。并且已經(jīng)出現(xiàn)不同腫瘤來源的 PDX模型隊(duì)列，這些模型可以代表不同腫瘤的腫瘤異質(zhì)性及遺傳多樣性[13,14]。PDX 是將患者的腫瘤組織直接接種于免疫缺陷動(dòng)物(如裸小鼠、NOD/SCID 小鼠或者NSG小鼠等)的背部皮下構(gòu)建成的，因相較于基于細(xì)胞系建立的異源移植腫瘤(CDX) 少了無限次傳代的過程，多了體內(nèi)環(huán)境，因此被認(rèn)為是最接近臨床患者腫瘤的體內(nèi)模型[15]。目前，PDX模型在肺癌、食道癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和胃癌等癌癥研究中應(yīng)用越來越多[16]。本課題旨在構(gòu)建肺鱗癌和肺腺癌PDX并進(jìn)行鑒定，即原代腫瘤及其PDX模型腫瘤組織作比較，檢測兩者在組織學(xué)和病理學(xué)上的差異，以期為患者進(jìn)行個(gè)體化治療提供藥物篩選的依據(jù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的工具，并為研究經(jīng)過各項(xiàng)治療后患者腫瘤細(xì)胞發(fā)生各種突變的情況和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 患者腫瘤標(biāo)本

肺癌腫瘤標(biāo)本來自2016年4月～2017年4月南京總醫(yī)院心胸外科，標(biāo)本獲取前已通過倫理審核，并得到患者及家屬同意。標(biāo)本經(jīng)過該院病理科進(jìn)行了組織病理證實(shí)，肺癌患者26例，男23例，女3例，年齡51～78歲，平均年齡62.6歲。本文所選病患均為初次手術(shù)且未做任何術(shù)前治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)6～8 周齡雄性BALB/c裸小鼠240只，體質(zhì)量20～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016 -0006]，飼養(yǎng)在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(蘇)2013-0052]。

1.3 構(gòu)建人肺癌PDX 模型

取患者新鮮腫瘤組織標(biāo)本(F0)，直徑10 mm，取材后立即置于新鮮培養(yǎng)基內(nèi)冷藏保存。將腫瘤分割成1 mm×1 mm×1 mm大小的腫瘤組織塊，將組織塊移植到4只裸小鼠的皮下，為第1代(F1)。剩下的腫瘤組織, 一半置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛中固定;另一半用液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱內(nèi)保存。當(dāng)皮下生長的腫瘤至對(duì)數(shù)生長期，完整剝離腫瘤并切割成1 mm×1 mm×1 mm大小的腫瘤組織塊，將組織塊移植到另外4只小鼠的皮下，此為第2代(F2)。操作過程在超凈工作臺(tái)中完成。傳至第4代(F4), 分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 甲醛固定和液氮冷凍，進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色、免疫組織化學(xué)(IHC)染色和實(shí)時(shí)熒光定量檢測。

1.4 HE和IHC分析

將原代腫瘤組織和裸小鼠體內(nèi)傳至F4代的腫瘤組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，組織切片并進(jìn)行HE染色，觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)、P63檢測采用IHC Envision二步法，應(yīng)用福州邁新公司生產(chǎn)的即用型試劑盒及即用型抗TTF-1、P63抗體。所有組織標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，脫蠟水化。主要試劑中鼠抗人TTF-1、p63蛋白單克隆抗體及 EnVision 二步法試劑盒均為丹麥DAKO公司產(chǎn)品。嚴(yán)格按IHC試劑盒說明書進(jìn)行操作。

本研究中TTF-1、P63 的IHC染色的判斷方法和標(biāo)準(zhǔn)是: 光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)300個(gè)癌細(xì)胞; TTF-1和P63蛋白陽性細(xì)胞則指腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核染色，而細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜未見染色。腫瘤組織中不超過10%的癌細(xì)胞染色為陰性，超過10%的癌細(xì)胞染色為陽性; 當(dāng)標(biāo)本細(xì)胞幾乎全部表達(dá)陰性但局灶區(qū)域呈強(qiáng)陽性表達(dá)時(shí)記為局灶陽性，本研究中局灶陽性記為陽性范疇[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

病患臨床數(shù)據(jù)與PDX成瘤率采用卡方檢驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。

2 結(jié)果

2.1 PDX建立情況和影響因素分析

裸小鼠移植腫瘤的生長情況:共取26例人肺癌新鮮標(biāo)本組織塊種植于裸小鼠，穩(wěn)定傳至第4代，共有9例(接種成瘤率34.6%)在裸小鼠體內(nèi)成瘤，建模成功的人肺癌患者的臨床資料見表1。NSCLC患者腫瘤接種模型成功的單因素分析結(jié)果見表2。對(duì)成瘤率與患者的一些臨床參數(shù)做了相關(guān)性分析，均為計(jì)數(shù)資料不足且不符合正態(tài)分布，采用卡方檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明患者年齡與成瘤率無關(guān)(P=0.322),與患者性別、是否吸煙、手術(shù)病理分期等也無關(guān)，但是與病理分類即組織學(xué)亞型有一定的相關(guān)性(P=0.048)。

2.2 皮下移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化

從圖1 中看出，肺癌原代腫瘤組織塊和接種于裸小鼠體內(nèi)并穩(wěn)定傳至第4代的移植瘤均有腫瘤細(xì)胞生長; PDX模型和原代腫瘤具有相同的組織學(xué)特點(diǎn)和排列結(jié)構(gòu)，較好地保持了腫瘤細(xì)胞原有的排列結(jié)構(gòu)和腫瘤細(xì)胞的異型性。

2.3 原代腫瘤和PDX F4模型中TTF-1和P63表達(dá)情況

如圖2所示, TTF-1在肺腺癌及其PDX 模型中均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，平均陽性率分別為86%和81.5%(P＞0.05); 而在肺鱗癌及其PDX模型中均呈陰性表達(dá)，即其陽性率低于10%。P63在肺鱗癌中及其PDX模型中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，平均陽性率分別達(dá)到84.3%和91% (P＞0.05); 而在肺腺癌及其PDX模型中陽性表達(dá)率均低于10%，為陰性表達(dá)。

表 1 成功建模的患者臨床資料

表 2 NSCLC患者腫瘤接種模型的單因素分析

3 討論

肺癌是對(duì)人類威脅最大的疾病之一，而占85%的NSCLC作為肺癌的主要組成部分，如何進(jìn)一步探索其生物學(xué)特征，利用適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物工具研究其分子機(jī)制和臨床治療方法，一直是人們研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。肺癌動(dòng)物模型作為研究癌變機(jī)制、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段，一直是研究人員關(guān)注和努力革新的對(duì)象。傳統(tǒng)癌癥研究模型為癌細(xì)胞株，但是這種癌癥細(xì)胞株在體外培養(yǎng)傳代多次后，基因組結(jié)構(gòu)或許發(fā)生了改變，研究結(jié)果不適宜轉(zhuǎn)化到臨床[17]; 發(fā)展到細(xì)胞株移植模型，這種模型是早期的動(dòng)物移植模型，相對(duì)于細(xì)胞株模型能更好用于研究，但是仍然用到體外傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株, 沒有原腫瘤生長的微環(huán)境，缺乏腫瘤細(xì)胞周圍的間質(zhì)成分及血管，也不能很好模擬人NSCLC的異質(zhì)性[18]。本研究團(tuán)隊(duì)建立NSCLC的PDX模型, 為NSCLC的研究提供合適研究平臺(tái)。

PDX模型研究提示其可以最大程度上保留來源腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)[19,20], 為了確認(rèn)NSCLC的 PDX 模型是否對(duì)肺癌患者有同樣的代表性，本研究進(jìn)一步比較了肺癌 PDX 模型與所來源患者腫瘤的組織學(xué)特點(diǎn)，與其他腫瘤的PDX模型類似，本文中肺癌PDX模型保持了所來源腫瘤組織的病理學(xué)特點(diǎn)。另外，張鵬等[21]報(bào)道，NSCLC中TTF-1、P63分別對(duì)肺腺癌、鱗癌有較強(qiáng)的提示作用，可用來作為肺癌的生物學(xué)標(biāo)記物, 其聯(lián)合應(yīng)用有利于NSCLC的診斷及鑒別。對(duì)于常見的肺癌腫瘤標(biāo)志分子的表達(dá)，如 TTF-1和P63 等，肺癌 PDX 也與患者來源腫瘤保持一致。這提示肺癌 PDX 模型對(duì)來源腫瘤的代表性非常好，是可以代表所來源患者的腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)。唐詩聰?shù)萚22]的論文中熒光定量PCR檢測結(jié)果提示肺癌PDX模型中的移植瘤所表達(dá)的基因?yàn)槿嗽椿颉；蚣暗鞍妆磉_(dá)證實(shí)建模成功,則進(jìn)一步說明移植瘤為人源性腫瘤。但是，畢竟與患者來源腫瘤不同，肺癌 PDX 模型失去了人的間質(zhì)組織，取代的是小鼠的間質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)由于接種小鼠均為免疫缺陷鼠，使得 PDX 模型缺乏免疫細(xì)胞的浸潤，因此肺癌PDX 模型可代表所來源腫瘤的部分生物學(xué)特點(diǎn)[23]，但是仍與患者來源的腫瘤有巨大差異，已有學(xué)者對(duì)目前的 PDX 模型進(jìn)行改進(jìn)，如將動(dòng)物微環(huán)境進(jìn)行人源化處理等[24]，但是效果如何仍需進(jìn)一步研究。 目前研究[14]認(rèn)為具有分子遺傳學(xué)背景數(shù)據(jù)的 PDX 模型在腫瘤臨床轉(zhuǎn)化研究過程中更具有價(jià)值。我們計(jì)劃下一步通過二代測序的方法對(duì)肺癌 PDX 模型進(jìn)行檢測，描繪肺癌PDX 模型的基因組與表達(dá)譜的特點(diǎn)，繼而分析我們?cè)?PDX 模型中檢測到常見的突變與肺癌患者組織的測序數(shù)據(jù)是否一致。

圖 1 患者原代腫瘤及其PDX F4模型腫瘤組織HE染色圖Figure 1 HE of patient tumor and patient-derived tumor xenograft F4 model tumor

圖 2 TTF-1和P63分別在NSCLC及其PDX模型腫瘤組織中的表達(dá)(IHC× 400)Figure 2 Expression of TTF-1and P63 in NSCLCs and their PDX model tissue (IHC× 400)

本研究構(gòu)建了肺癌PDX 模型，采用卡方檢驗(yàn)的方法分析了臨床數(shù)據(jù)與建立PDX模型成功率之間的關(guān)系，得出結(jié)論: 肺癌PDX模型構(gòu)建是否成功與病理分類即組織學(xué)亞型有一定的相關(guān)性; 并且在病理學(xué)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)的層面上證實(shí)了這些模型對(duì)臨床患者腫瘤的代表性，后期期望證實(shí)PDX 指導(dǎo)的藥物臨床試驗(yàn)在肺癌患者中是可以實(shí)施的，并且擬通過二代測序等高通量技術(shù)能夠詳細(xì)描繪了 PDX 的基因組及表達(dá)譜特征。肺癌治療中缺乏個(gè)體化用藥的經(jīng)驗(yàn)，肺癌患者同時(shí)進(jìn)行 PDX 及相應(yīng)患者的用藥，將有助于對(duì)藥物開發(fā)及敏感標(biāo)志篩選，是實(shí)現(xiàn)肺癌的精準(zhǔn)治療的必經(jīng)之路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Polo V, Besse B. Maintenance strategies in stage IV no-smallcell lung cancer (NSCLC): in which patients, with which drugs? [J]. Ann Oncol, 2013, 25(7):1283-1293.

[2] Domingues D, Turner A, Silva MD, et al. Immunotherapy and lung cancer: current developments and novel targeted therapies[J]. Immuotherapy, 2014, 6(11):1221-1235.

[3] Sher T, Dy GK, Adjei AA. Small cell lung cancer[J]. Mayo Clin Proc, 2008, 83(3):355-367.

[4] Molina JR, Yang P, Cassivi SD, et al. Non-small cell lung cancer:epidemiology, risk factors,treatment,and survivorship[J].Mayo Clin Proc, 2008, 83(5):584-594.

[5] Chen W, He J. Annual report on status of Cancer in China [J].Chin J Cancer Res, 2015, 27(1):2-12.

[6] McNeill RS, Vitucci M, Wu J, et al. Contemporary murine models in preclinical astrocytoma drug development[J].Neuro Oncol, 2015, 17(1):12-28.

[7] Fiebig HH, Neumann HA, Henss H, et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice [J].Recent Results Cancer Res, 1985, 97:77-86.

[8] Houghton A, Houghton PJ, Green AA. Chemotherapy of childhood rhabdomyosarcomas growing as xenografts in immune-deprived mice[J]. Cancer Res, 1982, 42(2):535-539.

[9] Sia D, Moeini A, Labgaa I, et al. The future of patient-derived tumor xenografts in cancer treatment[J]. Pharmacogenomics,2015, 16(14):1671-1683.

[10] Tentler JJ, Tan AC, Weekes CD, et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2012, 9(6):338-350.

[11] Siolas D, Hannon GJ. Patient-derived tumor xenografts:transforming clinical samples into mouse models[J].Cancer Res, 2013, 73(17):5315-5319.

[12] Izumchenko E, Meir J, Bedi A, et al. Patient derived xenografts as tools in pharmaceutical development[J]. Clin Pharmacol Ther, 2016, 99(6):612-621.

[13] Sun S, Zhang Z. Patient-derived xenograft platform of OSCC:a renewable human bio-bank for preclinical cancer research and a new co-clinical model for treatment optimization[J].Front Med, 2016, 10(1):104-110.

[14] Gao H, Korn JM, Ferretti S, et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response[J]. Nat Med, 2015, 21(11):1318-1325.

[15] McNeill RS, Vitucci M, Wu J, et al. Contemporary murine models in preclinical astrocytoma drug development[J].Neuro Oncol, 2015, 17(1):12-28.

[16] Chijiwa T, Kawai K, Noguchi A, et al. Establishment of patient-derived cancer xenografts in immunodeficient NOG mice[J]. Int J Oncol, 2015, 47(1):61-70.

[17] Burchill SA. What do, can and should we learn from models to evaluate potential anticancer agents [J]. Future Oncol,2006, 2(2):201-211.

[18] Gillet JP, Calcagno AM, Varma S, et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(46):18708-18713.

[19] Choi YY, Lee JE, Kim H, et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer[J]. Sci Rep, 2016, 6:22172.

[20] Pan CX, Zhang H, Tepper CG, et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy [J]. PLoS One, 2015,10(8):e0134346.

[21] 張鵬, 韓一平, 黃玲, 等. TTF-1 和p63在NSCLC組織中的表達(dá)及臨床意義 [J]. 中國肺癌雜志2009, 9, 12(9):995-999.

[22] 唐詩聰, 潘泓, 黃耀元, 等. 人非小細(xì)胞肺癌裸鼠移植瘤模型的建立[J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 38(2):28-32.

[23] Cho SY, Kang W, Han JY, et al. An integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient-Derived Xenografts[J]. Mol Cells, 2016, 39(2):77-86.

[24] Morton JJ, Bird G, Keysar SB, et al. Xact mice: humanizing mouse bone marrow enables microenvironment reconstitution in a patient-derived xenograft model of head and neck cancer[J]. Oncogene, 2016, 35(3):290-300.