嚙齒類螺桿菌SYBR Green II熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

孫靖諭, 謝靈志, 馮 潔, 于 寧, 錢(qián) 淼, 曹舒揚(yáng), 張 泉

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009; 2. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203)

嚙齒類螺桿菌(helicobacter rodentium)屬螺桿菌屬, 為革蘭氏陰性菌。自1992年Lee等首次從小鼠中分離到小家鼠類螺桿菌后, 目前已分離到至少13種嚙齒類動(dòng)物螺桿菌[1], 其中膽汁螺桿菌(helicobacter bilis)、肝螺桿菌(helicobacter hepaticus)、嚙齒類螺桿菌為較重要的感染嚙齒類動(dòng)物的螺桿菌[2], 主要存在于消化道，包括盲腸、結(jié)腸以及肝膽等器官[3]。嚙齒類螺桿菌會(huì)引起動(dòng)物疾病，更易以隱性感染形式存在于免疫缺陷型動(dòng)物中, 實(shí)驗(yàn)小鼠感染嚙齒類螺桿菌會(huì)導(dǎo)致肝炎、盲腸結(jié)腸炎等多種腸肝疾病[4], 混合感染嚙齒類螺桿菌和膽汁螺桿菌會(huì)引起腹瀉[5]。因此，若在科研或生物安全性評(píng)價(jià)等試驗(yàn)中采用此類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)造成影響，結(jié)果缺乏可靠性。

由于螺桿菌屬的細(xì)菌需在微氧環(huán)境中生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)苛，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，且菌落、菌體形態(tài)差異小，細(xì)菌的培養(yǎng)鑒定有一定困難[6]。熒光定量PCR是將PCR技術(shù)和光譜技術(shù)相結(jié)合的一種核酸定量檢測(cè)技術(shù)，具有更好的靈敏度[7]。16S rRNA具有高度保守穩(wěn)定的特性，被稱為細(xì)菌界的“分子化石”[8]，在分子診斷和遺傳進(jìn)化分析中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究以SYBR Green Ⅱ?yàn)闊晒馊玖?，?6S rRNA為靶基因，建立嚙齒類螺桿菌的熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，以期為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病原微生物診斷提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品檢測(cè)

嚙齒類螺桿菌、肝螺桿菌、膽汁螺桿菌基因組DNA由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，糞便樣品來(lái)源于江蘇省某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)單位的大、小鼠，共28份。

1.2 主要試劑

糞便基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司; SYBR Primer Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 公布的Helicobacterrodentium16S ribosomaL RNA基因序列(序列號(hào)：U96297.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物正向: 5'-GAGATAGTGGAGTGCTAGC-3'; 反向: 5'-GCTCCATTTCACAATATTGC-3'，目的片段大小為268 bp。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 熒光定量PCR擴(kuò)增與反應(yīng)條件優(yōu)化

采用SYBR Primer Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行體系優(yōu)化，以出現(xiàn)最高熒光值、最小循環(huán)數(shù)以及在溶解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性峰作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行熒光定量PCR條件篩選優(yōu)化。通過(guò)對(duì)SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR條件的優(yōu)化，確定反應(yīng)體系為20 μL，包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL, 上游引物(20 μmol/L)helicobacter rodentium-16S rRNA-F 0.2 μL, 下游引物(20 μmol/L)helicobacter rodentium-16S rRNA-R 0.2 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，DNA 模板 1 μL，H2O 8.2 μL。循環(huán)數(shù)為40次，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s, 40 個(gè)循環(huán); 95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 15 s。繪制熔解曲線。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以gDNA為模板DNA, 通過(guò)普通PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收試劑盒回收后, 與磷酸受納蛋白(PLB)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α, 篩選得到陽(yáng)性菌落, 提取質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板并定量，利用公式N=(C×10-9)/(M×660)×6.02×1023進(jìn)行拷貝數(shù)換算, 其中N為每微升標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù), C為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(ng/μL)，M為標(biāo)準(zhǔn)品堿基數(shù)。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，將3×102拷貝數(shù)/μL～3×107拷貝數(shù)/μL 6個(gè)稀釋濃度作為模板進(jìn)行熒光定量PCR。以6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)所得的Ct值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.6 特異性試驗(yàn)

以嚙齒類螺桿菌基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照模板，膽汁螺桿菌、肝螺桿菌和彎曲桿菌DNA為陰性對(duì)照，雙蒸水為空白對(duì)照，通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，檢測(cè)該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍梯度稀釋后, 取濃度為3×100～3×107拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，同時(shí)做普通PCR 檢測(cè)。以確定熒光定量PCR和普通PCR的最低檢測(cè)濃度并進(jìn)行敏感性比較。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取3×106拷貝/μL和3×104拷貝/μL的基因組DNA進(jìn)行重復(fù)性熒光定量PCR實(shí)驗(yàn), 組內(nèi)試驗(yàn)與組間試驗(yàn)分別重復(fù)3次和2次, 記錄Ct值, 分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、組間變異系數(shù), 以此反映該方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性, Ct值大于34, 視為陰性。

1.9 樣品檢測(cè)

使用糞便DNA提取試劑盒提取28份糞便標(biāo)本DNA，根據(jù)如上所示的熒光PCR體系及程序，并設(shè)陽(yáng)性及空白對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR擴(kuò)增與反應(yīng)條件優(yōu)化

將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 結(jié)果顯示所得到的片段大小與目的片段一致(268bp)(圖1)。產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析后顯示，與嚙齒類螺桿菌特異性目的片段的序列同源性達(dá)100%，確定為特異性目的片段。溶解曲線顯示，在86.61℃處出現(xiàn)特異性峰，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的峰值出現(xiàn)(圖2)。

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍系列稀釋, 取3×102～3×107拷貝/μL 的6個(gè)梯度濃度的質(zhì)粒作模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，制作動(dòng)力學(xué)曲線(圖3)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.603 1，截距為38.306，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 9，結(jié)果顯示具有良好的線性關(guān)系。動(dòng)力學(xué)曲線指數(shù)增長(zhǎng)階段和平臺(tái)期都完整，熒光定量PCR的結(jié)果是可靠的。

圖 1 嚙齒類螺桿菌16S rRNA 特異目的片段的PCR擴(kuò)增

圖 2 嚙齒類螺桿菌擴(kuò)增溶解曲線

圖 3 熒光PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線

圖 4 嚙齒類螺桿菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗(yàn)

以建立的熒光法定量PCR體系檢測(cè)肝螺桿菌、膽汁螺桿菌、嚙齒類螺桿菌、彎曲桿菌，設(shè)雙蒸水空白對(duì)照，結(jié)果僅嚙齒類螺桿菌發(fā)生了特異性擴(kuò)增，肝螺桿菌、膽汁螺桿菌、彎曲桿菌及空白對(duì)照均未發(fā)生任何擴(kuò)增，說(shuō)明該方法具有良好的特異性(圖 5)。

2.4 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后, 取濃度為3×100～3×107拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，同時(shí)做普通PCR檢測(cè)。多次實(shí)驗(yàn)后，空白對(duì)照Ct值均大于34，即為陰性，熒光定量PCR 檢測(cè)方法可以檢測(cè)到30個(gè)拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品，而常規(guī) PCR 僅能檢測(cè)到 300 個(gè)拷貝 /μL 的標(biāo)準(zhǔn)品(圖6)，表明建立的嚙齒類螺桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法具有較高的敏感性，比常規(guī)PCR至少高10 倍。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中的3×106拷貝/μL和3×104拷貝/μL兩個(gè)稀釋度的作為模板, 對(duì)這兩個(gè)稀釋度在不同時(shí)間段進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定, 每次對(duì)同一模板同時(shí)進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定及設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔, 結(jié)果表明, 3×104拷貝/μL組內(nèi)變異系數(shù)為0.1660%和0.7951%，3×106拷貝/μL組內(nèi)變異系數(shù)為 1.2583%和1.0846%，3×104拷貝/μL和3×106拷貝/μL組間變異系數(shù)分別為0.6546%和1.6337%, 組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%，說(shuō)明建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠。其中:變異系數(shù)(β)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/平均數(shù)(X)(表1)。

2.6 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)28只實(shí)驗(yàn)大、小鼠糞便DNA, 分別進(jìn)行常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測(cè), 結(jié)果常規(guī)PCR僅檢測(cè)出16號(hào)樣品感染嚙齒類螺桿菌，陽(yáng)性對(duì)照條帶明顯, 其余檢測(cè)樣品及空白對(duì)照均呈陰性(圖7); 熒光定量PCR檢測(cè)出1號(hào)、2號(hào)和21號(hào)樣品感染嚙齒類螺桿菌, 陽(yáng)性對(duì)照條帶明顯，其余樣品及空白對(duì)照均為陰性(圖8)。熒光定量PCR的檢出率高于常規(guī)PCR，靈敏度更高。

圖 5 嚙齒類螺桿菌熒光定量PCR特異性擴(kuò)增曲線

圖 6 熒光定量PCR與常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)

表 1 熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性

3 討論

嚙齒動(dòng)物螺桿菌在全球范圍內(nèi)廣泛存在。有報(bào)道[9]顯示，該菌對(duì)不同品系的大、小鼠均有感染，A/Jcr、SCID的感染率略高，同時(shí)對(duì)雄性的肝損傷略大于雌性。該菌大多以慢性感染的潛伏形式存在，但對(duì)于免疫缺陷動(dòng)物或免疫力降低的正常動(dòng)物，可表現(xiàn)為多類炎癥、腫瘤甚至死亡。嚙齒類螺桿菌的傳播途徑為“糞-口”途徑[10]，大多從離乳幼仔時(shí)期因攝入帶有螺桿菌的糞便開(kāi)始感染，通過(guò)長(zhǎng)期排便和空氣粉塵傳播進(jìn)一步感染其他個(gè)體[11]，因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行螺桿菌檢測(cè)可保證科學(xué)研究的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性?，F(xiàn)階段，我國(guó)檢測(cè)螺桿菌的技術(shù)手段相對(duì)缺乏，因此，建立嚙齒類螺桿菌快速、準(zhǔn)確的診斷方法具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有高敏感、特異性強(qiáng)、可重復(fù)、封閉式反應(yīng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[12]。該方法簡(jiǎn)化了瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟。本研究建立了嚙齒類螺桿菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法, 具有很強(qiáng)的特異性，其重復(fù)性試驗(yàn)的組內(nèi)變異系數(shù)的平均值為0.826%，組間變異系數(shù)的平均值為1.144%，顯示出了該方法具有良好穩(wěn)定性, 同時(shí)進(jìn)行的敏感性試驗(yàn)顯示出熒光定量PCR的靈敏度可達(dá)30拷貝/μL,明顯高于常規(guī)PCR。

圖 7 常規(guī)PCR臨床樣品檢測(cè)

圖 8 熒光定量PCR臨床樣品檢測(cè)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究以SYBR GreenⅡ?yàn)闊晒馊玖?，可用于嚙齒類螺桿菌感染的快速診斷，并可以進(jìn)行定量分析嚙齒類螺桿菌感染程度，此方法將為嚙齒類螺桿菌的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查等提供一種方便快捷的定量檢測(cè)技術(shù)。

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