鴨腸炎病毒感染誘導(dǎo)鴨胚成纖維細(xì)胞γ干擾素上調(diào)表達(dá)及初步機(jī)制的研究

李思琪, 尹海暢, 趙麗麗, 王怡平, 金建麗, 陳洪巖

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150069;2. 牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 牡丹江 157011)

鴨腸炎病毒 (duck enteritis virus, DEV)，又名鴨瘟病毒(duck plague virus, DPV), 是雙鏈線性DNA病毒，基因組大小約為150 kb，屬于皰疹病毒家族，皰疹病毒甲亞科，馬立克病毒屬。DEV形態(tài)呈球形，具有皰疹病毒的典型形態(tài)，包括核心、衣殼、外膜和囊膜四個(gè)部分。該病毒能夠感染多種水禽，導(dǎo)致嚴(yán)重的敗血癥性疾病，如鴨病毒性腸炎。該疾病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為水禽的血管損傷、消化道出血、黏膜損傷、淋巴器官受損以及其他退行性損傷。該疾病于1923年首次在荷蘭報(bào)道，隨后流行于多個(gè)國(guó)家和地區(qū)?？傮w來(lái)說(shuō)，DEV分布廣泛、傳播迅速，并且有很高的死亡率和發(fā)病率。這種病毒對(duì)全球范圍的水禽業(yè)造成了重大影響。盡管已有許多關(guān)于DEV基因組生物學(xué)方面的報(bào)道，但關(guān)于DEV與宿主細(xì)胞相互作用的研究依然落后于其他皰疹病毒科家族成員[1]。

干擾素(interferon, IFN)是一類(lèi)高活性多功能的糖蛋白, 是生物體內(nèi)一類(lèi)古老因子, 具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制細(xì)胞分裂等多種作用[2]。IFN分為三大類(lèi): I 型IFN、II 型IFN和III 型IFN。II型IFN具有抗病毒、抗腫瘤、影響細(xì)胞生長(zhǎng)等作用[3]。IFNγ屬于II型IFN，IFNγ是一種異型糖蛋白，它是由自然殺傷(NK)細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞在多種免疫刺激下產(chǎn)生的[4]。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)禽類(lèi)IFN的研究已有一定的進(jìn)展。龔永強(qiáng)等[5]利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)鴨IFNα成熟蛋白，并證明該蛋白對(duì)鴨瘟強(qiáng)毒有抑制作用，為以后臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。豐宗洋等[6]成功表達(dá)了雞 IFNα蛋白并研究了其抗病毒效果。周浩等[7]研究了H9N2禽流感病毒(H9N2)、坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)、鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus, GPV)對(duì)鵝I型和II型干擾素表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)H9N2、TMUV、GPV孵育外周血淋巴細(xì)胞后,均能顯著上調(diào)IFNα、IFNγ的表達(dá)。代麗等[8]成功表達(dá)雞IFNγ蛋白并研究其抗新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)活性。Chen等[9]研究表明鴨IFN刺激物(duSTING)能夠誘導(dǎo)鴨Ⅰ型干擾素并在抵抗鴨瘟病毒中具有重要作用。Qian等[10]研究表明鴨IFN調(diào)節(jié)因子1(duIRF1)，誘導(dǎo)鴨胚成纖維細(xì)胞(duck embryo fibroblasts，DEF)產(chǎn)生IFN和IFN刺激因子(interferon stimulated genes, ISGs)，能夠有效抑制DEV、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)等病毒的復(fù)制。Cheng等[11]研究表明雞DNA病毒傳感蛋白DDX41(chDDX41)激活I(lǐng)FNβ信號(hào)通路依賴(lài)于IFN刺激物(STING)。Yao等[12]研究了北京鴨IFNλ的克隆和表達(dá)。Long等[13]研究表明IFNγ可以提高DNA疫苗保護(hù)鴨的效率。Narayan等[14]在研究解決鴨乙型肝炎病毒感染時(shí), 表明在感染鴨的肝臟樣品中IFNγ表達(dá)量上調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)研究了DEV感染DEF誘導(dǎo)鴨IFNγ產(chǎn)生及其相關(guān)ISGs的激活情況，為深入研究DEV感染與宿主細(xì)胞相互作用提供了理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為水禽病的防控、凈化提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

DPV-CSC標(biāo)準(zhǔn)毒株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所; DEF細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Total RNA KitI(美國(guó)Omega公司，R6834-1);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(中國(guó)TaKaRa公司，6210A); FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)(瑞士Roche公司, 04913914001);胰酶消化液(TR)(美國(guó)Gibco公司); Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM，美國(guó)Gibco公司，C11995500BT); Fetal Bovine Serum(FBS，美國(guó)Clark公司，F(xiàn)B25015)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank上登錄的基因序列IFNγ(NM_001310417.1)、內(nèi)參基因(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)(XM_005016745)、抗黏液病毒基因(Myxovirus resistance, Mx)(KR025554)、2'-5'寡腺苷酸合成酶L(2'-5'oligoadenylates synthesis L, OASL)(KY775584.1)、DEAD框蛋白50(DEAD-box protein 50, DDX50)等分別設(shè)計(jì)熒光定量的PCR引物, 由博仕生物公司合成。引物序列如表1所示。

表 1 熒光定量PCR使用的引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.4 病毒感染步驟

制備DEF[15]，待單層DEF長(zhǎng)到細(xì)胞孔的80%時(shí)，按照感染復(fù)數(shù)(MOI)=1的劑量接種DEV，分別在感染24 h、36 h、48h、60 h收集細(xì)胞，未感染細(xì)胞作為對(duì)照。

1.5 細(xì)胞總RNA提取

用Total RNA Kit I試劑盒提取感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞的總RNA，按照說(shuō)明書(shū)方法操作。

1.6 cDNA合成

按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser的說(shuō)明書(shū)方法操作，將提取的細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

反應(yīng)體系(冰上操作): SYBR 10 μL，PCR 正向引物(濃度為 10 μmol/L) 0.5 μL，PCR 反向引物(濃度為 10 μmol/L) 0.5 μL, c DNA 2 μL，dH2O 7 μL，總反應(yīng)體積20 μL，反應(yīng)程序: 95 ℃, 5 min; 95 ℃，30 s; 52 ℃，30 s (IFNγ、MX 為52℃，OASL、DDX50為48 ℃); 循環(huán)反應(yīng)45次。每個(gè)樣品做三個(gè)復(fù)孔。運(yùn)用公式: 2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參照Ct值，△△Ct=病毒感染實(shí)驗(yàn)組△Ct -未感染對(duì)照組△Ct)對(duì)所測(cè)樣品Ct值進(jìn)行計(jì)算。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)均以表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞病變

從圖1可以看出，DEV感染DEF 48 h后，DEF的形態(tài)發(fā)生變化: 細(xì)胞透明度下降，胞質(zhì)顆粒增多，細(xì)胞濃縮、變圓，最后脫落(實(shí)驗(yàn)組); 沒(méi)有感染的DEF形態(tài)正常(對(duì)照組)。

2.2 IFNγ的mRNA表達(dá)

DEV(MOI=1)感染DEF后，于 24 h、36 h、48 h和60 h分別收集細(xì)胞提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 檢測(cè)IFNγ mRNA水平。結(jié)果如圖2、表2所示: 病毒感染細(xì)胞組IFNγ mRNA 水平在24 h上調(diào)不顯著，但在36 h、48 h和60 h均顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。

圖 1 DEV感染DEF的結(jié)果(×200)Figure 1 The result of DEV infected DEF (×200)

圖 2 不同時(shí)間點(diǎn)IFNγ的mRNA 表達(dá)水平Figure 2 Detection of the mRNA levels of IFNγ at different time

2.3 ISGs mRNA表達(dá)水平

DEV感染DEF后，分別于36 h和48 h收集細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA, qRT-PCR檢測(cè)各ISGsmRNA水平。結(jié)果如圖3所示, 病毒感染細(xì)胞組Mx、DDX50和OASLmRNA水平在36 h和48 h均顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討論

鴨病毒性腸炎是由DEV引起的一種急性、熱性、敗血型疾病[16]。其臨床表現(xiàn)以體溫顯著升高、兩腿酸軟無(wú)力等為主要特征。該病長(zhǎng)期危害養(yǎng)鴨業(yè)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。有報(bào)道[17]表明在H7N9 病毒感染健康鴨后，檢測(cè)出IFNγ水平的升高。II型干擾素在許多動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)具有抗病毒作用。DEV感染DEF，能否激活在抗病毒免疫中的II型干擾素應(yīng)答是值得研究探索的。

本研究中采用熒光定量PCR法檢測(cè)了DEV感染DEF后24 h、36 h、48 h和60 hIFNγ mRNA水平。結(jié)果顯示，病毒感染后細(xì)胞內(nèi)IFNγ mRNA水平在36 h、48 h和60 h均顯著升高。這一結(jié)果表明，DEV感染DEF激活了IFNγ的產(chǎn)生。IFN的抗病毒機(jī)制主要表現(xiàn)在其誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列IFN刺激基因(ISGs)的表達(dá)。這些抗病毒蛋白主要是通過(guò)激活細(xì)胞下游的蛋白或作用于病毒基因組而發(fā)揮抗病毒作用[18]。Mx蛋白是屬于GTPase超家族中的一員，具有抗病毒作用。Mx蛋白具有的三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域是其抗病毒作用的必須結(jié)構(gòu)[19]。Mx蛋白能夠抗多種病毒, 但具體的作用機(jī)制尚不清楚。IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的2'-5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)是重要的抗病毒蛋白。通過(guò)其催化產(chǎn)物激活核酸內(nèi)切酶RNaseL, 降解病毒RNA, 從而抑制病毒復(fù)制[20]。DEAD框蛋白家族的RNA解旋酶能夠調(diào)節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)，這項(xiàng)功能在許多基礎(chǔ)生物過(guò)程中起關(guān)鍵作用。 除了RNA代謝中的傳統(tǒng)功能之外, 已經(jīng)報(bào)道了DEAD框RNA解旋酶作為抗病毒先天免疫的介質(zhì),也是病毒復(fù)制的必需宿主因子[21]。因此，DEAD框RNA解旋酶家族成員在病毒感染期間起到促進(jìn)或抗病毒的作用。我們對(duì)DEV感染的DEF中幾種ISGs，如Mx、OASL、DDX50 mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，DEV感染DEF，誘導(dǎo)了Mx、OASL和DDX50的表達(dá)上調(diào)。

表 2 所測(cè)樣品的Ct 值及計(jì)算結(jié)果Table 2 Measured Ct value of the sample and calculated results

圖 3 各個(gè)ISGs的mRNA 表達(dá)水平Figure 3 Detection of the mRNA levels of ISGs

本研究證實(shí)了DEV感染DEF不同時(shí)間點(diǎn)能夠誘導(dǎo)II型IFN應(yīng)答，并且初步探索了其激活DEF中II型IFN應(yīng)答的機(jī)制。為深入研究DEV感染與宿主細(xì)胞相互作用提供了理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為水禽病的防控、凈化提供思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yin HC, Zhao LL, Li SQ, et al. Autophagy activated by duck enteritis virus infection positively affects its replication[J].JGV, 2017, 98(3):486-495.

[2] 高建忠, 祝衛(wèi)東, 黃玉幫. 干擾素的研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué),2003, 21(1):58-59.

[3] 劉媛媛, 寶福凱, 柳愛(ài)華, 等. γ干擾素與結(jié)核病關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué), 2012, 12(10):1275-1281.

[4] 楊生海, 殷宏, 劉永生, 等. γ干擾素研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2010(8):29-34.

[5] 龔永強(qiáng), 程安春, 汪銘書(shū), 等. 鴨IFNα成熟肽基因的原核表達(dá)、復(fù)性及其抗病毒活性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(12):1753-1758.

[6] 豐宗洋. 雞α干擾素的原核表達(dá)及其抗病毒效果研究[D].太原: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[7] 周浩. 鵝I型和II型干擾素免疫學(xué)特性及抗病毒功能研究[D]. 成都: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[8] 代麗, 單安山, 孫進(jìn)華, 等. 雞γ干擾素的可溶性表達(dá)及純化產(chǎn)物的抗NDV活性[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 42(9):37-42.

[9] Chen S, Wu Z, Zhang J, et al. Duck stimulator of interferon genes plays an important role in host anti-duck plague virus infection through an IFN-dependent signalling pathway[J].Cytokine, 2017, S1043-4666(17):30265-X.

[10] Qian W, Wei X, Li Y, et al. Duck interferon regulatory factor 1 acts as a positive regulator in duck innate antiviral response[J]. Dev Comp Immunol, 2017, 78:1-13.

[11] Cheng Y, Liu Y, Wang Y, et al. Chicken DNA virus sensor DDX41 activates IFN-β signaling pathway dependent on STING.[J]. Dev Comp Immunol, 2017, 76:334-342.

[12] Yao Q, Fischer KP, Arnesen K, et al. Molecular cloning,expression and characterization of Pekin duck interferon-λ[J].Gene, 2014, 548(1):29-38.

[13] Long JE, Huang LN, Qin ZQ, et al. IFN-gamma increases efficiency of DNA vaccine in protecting ducks against infection[J]. World J Gastroentero, 2005, 11(32):4967-4973.

[14] Narayan R, Buronfosse T, Schultz U, et al. Rise in gamma interferon expression during resolution of duck hepatitis B virus infection[J]. JGV, 2006, 87(Pt 11):3225.

[15] 龔永強(qiáng). 鴨α干擾素基因的原核表達(dá)及抗病毒活性研究[D].成都: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[16] Berger PH, Adams MJ, Barnett OW. Virus taxonomy:eight report of the international committee on taxonomy of viruses[M]. London: Elsevier Academic Press, 2004:819-841.

[17] Cornelissen JB, Post J, Peeters B, et al. Differential innate responses of chickens and ducks to low-pathogenic avian influenza[J]. Avian Pathol, 2012, 41(6):519.

[18] 李公美. 吉林白鵝IFNα/γ原核表達(dá)、抗病毒活性及其核酸疫苗免疫佐劑作用的研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[19] 譚宗成. 雞α干擾素基因及其下游基因Mx的研究[D]. 汕頭: 汕頭大學(xué), 2008.

[20] 陳偉卓, 高向東, 徐晨, 等. 2'-5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)及其臨床意義的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013,13(36):7165-7170.

[21] Feng T, Sun T, Li G, et al. DEAD-Box helicase DDX25 Is a negative regulator of type i interferon pathway and facilitates RNA virus infection[J]. Front Cell Infect Microbiol,2017, 7:356.