皖南牛Y-STRs與Y-SNPs遺傳多樣性研究

侯佳雯，夏小婷，賈玉堂，劉善齋，黨瑞華，陳 宏，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技系統(tǒng)，陜西 楊凌 712100；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031；3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系亳州綜合試驗站，安徽 亳州 236800)

皖南牛主要產(chǎn)于安徽省長江以南的涇縣、黟縣、歙縣、績溪、旌德，在皖浙、皖贛交界山區(qū)亦有分布。主產(chǎn)區(qū)地勢較高，地形錯綜復(fù)雜，大致可分為高山和中山區(qū)(海拔500 m以上)、低山丘陵區(qū)(海拔250 m左右)和盆谷區(qū)，當?shù)刈匀粭l件好、氣候溫暖、草場廣、牧地多，是發(fā)展草食性家畜的天然基地[1]。皖南牛為役肉兼用品種，具有耐耙、耐粗飼、耐熱等特性，肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，是我國優(yōu)良的地方黃牛品種之一[2]。目前，有關(guān)皖南牛Y染色體遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳背景的研究未見報道。

Y染色體遵循父系遺傳，單倍型保持完整，不易受重組和回復(fù)突變影響，突變率低、穩(wěn)定遺傳，是研究物種進化和遺傳多樣性的良好標記。近年來，基于家牛Y染色體單核苷酸多態(tài)性標記(Y-SNPs)的研究表明[3-5]，家牛由3種Y染色體單倍型組組成(即普通牛Y1和Y2單倍型組，瘤牛Y3單倍型組)。在Y-STRs標記多態(tài)性研究方面，發(fā)現(xiàn)歐亞牛、非洲牛和歐洲牛父系存在不同的單倍型組[4,6]；Cai等[7]通過對中國地方黃牛品種進行Y-STRs多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)2個Y-STRs位點具有明顯的多態(tài)性，可以區(qū)分普通牛和瘤牛血統(tǒng)。Li等[8]利用4個Y-SNPs標記和2個Y-STRs標記對16個中國黃牛品種進行多態(tài)性分析，表明中國黃牛主要存在普通牛Y2和瘤牛Y3兩個父系起源，且各品種的Y染色體單倍型組呈現(xiàn)出清晰的地理分布規(guī)律。

因此，本研究利用2個Y-SNPs標記和2個Y-STRs標記聯(lián)合分析皖南牛的父系起源、遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，旨在為今后開展皖南牛的保種與選育工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

從安徽省皖南牛保種場采集35頭皖南牛公牛耳組織，放在75%酒精中帶回實驗室保存，采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴增

選用G?therstr?m等[3]和Ginja等[4]報道的2個家牛Y-SNPs標記(即UTY-19和ZFY-10)引物信息和家牛2個經(jīng)典的Y-STRs位點，即INRA189和BM861標記，參照Edwards等[6]報道的位點信息研究皖南牛的父系起源，引物信息詳見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 家牛Y-SNPs與Y-STRs標記的信息

PCR體系(25 μL)為：2×PrimeSTAR Max Premix(上海寶生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水12.5 μL。

PCR反應(yīng)程序為：98℃變性10 s，X℃(見表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35個循環(huán)，后冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含GoldView核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。

1.3 測序、單倍型組分型及單倍型多樣度分析

將PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA測序儀(Applied Biosystems公司)進行正、反向測序，測序結(jié)果用Chromas2.3軟件進行核實查看和校正，獲得每頭皖南牛公牛2個Y-SNPs標記的序列多態(tài)性。利用熒光標記2個Y-STR位點INRA189和BM861，進行毛細管電泳分析，根據(jù)G?therstr?m等[3]和Li等[8]報道的Y染色體微衛(wèi)星分型，確定不同個體的單倍型，用Arlequin3.5軟件進行群體單倍型多樣度分析。

2 結(jié)果與分析

通過對35頭皖南牛2個Y-SNPs標記(即UTY-19和ZFY-10)PCR擴增產(chǎn)物進行測序，發(fā)現(xiàn)UTY-19標記存在C>A顛換，而ZFY-10標記存在C>T顛換和1個GT核苷酸插入/缺失多態(tài)位點。對照G?therstr?m等[3]和Ginja等[4]報道的家牛Y染色體單倍型組的判定標準，并依據(jù)2個標記的核苷酸變異確定單倍型組，結(jié)果顯示：35頭皖南牛有Y1、Y2和Y3 3種單倍型組，Y2和Y3單倍型組的頻率分別為8.56%(3/35)和88.58% (31/35)，其中只有1個個體為Y1單倍型組，頻率為2.86%，表明皖南牛以Y3單倍型為主。皖南牛的Y染色體單倍型多樣度為0.2185±0.0924。

利用2個家牛Y染色體特異性微衛(wèi)星標記(即INRA189和BM861)分析皖南牛的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，INRA189標記在皖南牛中檢測到5個等位基因，其中1個等位基因(98 bp)對應(yīng)Y1單倍型組，3個等位基因(102 bp、104 bp和106 bp)對應(yīng)Y2單倍型組，1個等位基因(88 bp)對應(yīng)Y3單倍型組。在BM861位點中，皖南牛的等位基因大小為158 bp和156 bp，分別對應(yīng)普通牛和瘤牛單倍型組。

結(jié)合Y-SNPs和Y-STRs標記聯(lián)合分析，在35頭皖南牛中共界定了5種單倍型，包括1個Y1單倍型(Y1-98-158)、3個Y2單倍型(Y2-102-158、Y2-104-158和Y2-106-158)和1個Y3單倍型(Y3-88-156)(表2)，其中Y3-88-156單倍型占絕對優(yōu)勢(88.57%)。

表2 皖南牛Y染色體單倍型頻率

3 討論

近年來，Y-SNPs和Y-STRs被廣泛應(yīng)用于群體遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和父系起源研究[3-9]。G?therstr?m等[3]和Ginja等[4]研究表明，歐洲牛為普通牛起源，其中Y1單倍型組主要分布在北歐，Y2單倍型組主要分布在南歐。Edwards等[6]在此基礎(chǔ)上通過分析138個歐洲和亞洲品種，進一步說明歐洲牛只存在普通牛血統(tǒng)，亞洲西南部主要為瘤牛起源。

皖南牛是安徽省優(yōu)良的地方品種，系南方黃牛類型。目前，關(guān)于皖南牛這一地方品種在分子水平上的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和父系起源的報道甚少。常振華等[9]利用兩個Y-STRs位點對11個皖南牛個體進行分析，發(fā)現(xiàn)皖南牛全部為瘤牛血統(tǒng)；Li等[8]利用Y-SNPs和Y-STRs聯(lián)合分析，結(jié)果同樣支持皖南牛為瘤牛父系起源。本研究通過對35頭皖南牛公牛進行Y-SNPs分析，檢測到皖南牛以瘤牛Y3單倍型組(88.57%)為主，并有少量普通牛Y1單倍型組(2.86%)和Y2單倍型組(8.57%)。該結(jié)果與Li等[8]提出的Y3單倍型組主導(dǎo)南方黃牛觀點一致，這可能與地理隔離和氣候狀況相關(guān)。35頭皖南牛中發(fā)現(xiàn)1個個體為Y1單倍型組，這1個個體很可能是由于引入中國的歐美肉牛品種改良皖南牛品種，由雄性介導(dǎo)的基因滲入所致[9]。趙曉誠等[10]利用Y-SNPs標記對陜西嶺南牛的分析，發(fā)現(xiàn)嶺南牛屬于南方黃牛類型，僅有普通牛Y2和瘤牛Y3 起源，沒有Y1起源，表明Y1單倍型組在中國地方黃牛中確實占的比例很低，支持Y1單倍型組來源于國外引入品種的觀點。

Y染色體微衛(wèi)星位點INRA189和BM861是區(qū)別普通牛和瘤牛的經(jīng)典標記。Edwards等[6]發(fā)現(xiàn)INRA189位點的大小在90～106 bp之間，BM861的位點大小為156 bp和158 bp。本研究結(jié)果顯示，INRA189鑒定出5種不同大小的等位基因，分別為98 bp、102 bp、104 bp、106 bp和88 bp；BM861鑒定出2種等位基因，即156 bp和158 bp。該結(jié)果與Edwards等[6]的一致，說明INRA189和BM861兩個微衛(wèi)星位點能清晰地區(qū)分出皖南牛中的普通牛和瘤牛血統(tǒng)。

單倍型多樣度是衡量群體DNA遺傳多樣性的重要指標之一。Edwards等[6]對138個家牛品種的Y染色體遺傳多樣性進行分析，結(jié)果顯示單倍型多樣度平均值為0.4220。Li等[8]對16個中國地方黃牛品種的父系遺傳多樣性分析，表明其單倍型多樣度平均值為0.5180，其中南方黃牛的單倍型多樣度平均值為0.3120。在本研究中，35頭皖南牛的單倍型多樣度為0.2185，低于Edwards等[6]檢測的國外牛品種的單倍型多樣度平均值，同時也低于Li等[8]報道的中國南方黃牛平均值，表明皖南牛Y染色體單倍型多樣度較低，這可能與皖南牛以本交為主，現(xiàn)多處于農(nóng)戶自繁自養(yǎng)狀態(tài)相關(guān)[1]。另一方面，也說明皖南黃牛父系種質(zhì)資源比較純正，遺傳穩(wěn)定。

皖南牛是中國優(yōu)良的地方牛種之一。近年來，皖南黃牛養(yǎng)殖量大幅下降可能是雜交牛肉低價格沖擊、散養(yǎng)戶養(yǎng)殖越來越少[2]的原因所致。此外，外來品種雜交導(dǎo)致皖南牛的基因構(gòu)成產(chǎn)生變化，加之人們對種質(zhì)資源保護意識淡薄，導(dǎo)致皖南牛養(yǎng)殖數(shù)量急劇下降。因此，應(yīng)當加大皖南牛保種開發(fā)力度，建立健全皖南牛的保種體系，使得這一優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源得以保護和開發(fā)利用。

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[10] 趙曉誠，林清，左自意，等. 嶺南黃牛Y-SNP遺傳多樣性與父系起源研究[J].中國牛業(yè)科學(xué),2017,43(4):4-6.