致奶牛乳房炎大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

高建鵬，張子榮，張奇波，楊 武，齊亞銀*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 五家渠 931300；3.新疆克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，新疆 克拉瑪依 834000)

奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎，主要是由于奶牛乳腺受微生物、物理、化學(xué)和環(huán)境等因素刺激從而產(chǎn)生的一類炎癥反應(yīng)。奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)常見的一種臨床疾病，引起乳房炎的微生物種類有很多,如細(xì)菌、病毒、真菌、支原體等,人們己從乳房炎的乳汁中分離到了130多種微生物,較常見的有20多種,以細(xì)菌感染比較多見,其中大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌具有國際廣泛性,是引發(fā)乳房炎的主要致病菌,也有少數(shù)病原菌如大腸桿菌、化膿棒狀桿菌、蠟樣芽抱桿菌、綠膿桿菌等也可引起地方性流行。此外有人發(fā)現(xiàn)，乳粉抱霉、馬紅球菌、糞產(chǎn)堿桿菌、克柔氏念珠菌、粘質(zhì)沙雷氏菌等一些國內(nèi)外未見報(bào)道的病原微生物也可引起奶牛乳房炎。

大腸桿菌一直被認(rèn)為是環(huán)境致病菌,但是近年來有人提出將其列為傳染性致病菌。大腸桿菌具有很多毒力因子,其中LSP是大腸桿菌主要的致病毒力因子,能夠引起動(dòng)物機(jī)體急性炎癥過程。奶牛發(fā)生大腸桿菌性乳房炎時(shí),多為急性炎癥過程,機(jī)體過度的炎癥反應(yīng)造成了乳腺上皮細(xì)胞的損傷、脫落,從而降低了產(chǎn)奶量,甚至?xí)鹉膛Ｈ閰^(qū)的萎縮、壞死而喪失生產(chǎn)性能并可能誘發(fā)敗血癥,導(dǎo)致急性死亡。給奶牛養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2016年9月，新疆北疆地區(qū)某規(guī)?；?chǎng)的部分奶牛發(fā)生了以乳房炎為主要特征的病例，患牛體溫升高、精神沉郁、食欲不佳。乳房觸摸有硬塊，乳房或乳頭腫脹，乳汁中有絮片、凝塊，部分乳汁為血乳，乳汁顏色發(fā)黃或發(fā)紅，產(chǎn)奶量減少或無奶。為查明導(dǎo)致該病發(fā)生的主要致病菌，提供一套治療方案，本研究對(duì)患乳房炎的奶牛進(jìn)行了病原菌的分離和鑒定，為篩選敏感藥物及科學(xué)防治奶牛乳房炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 新疆石河子某發(fā)病牛場(chǎng)的臨床性乳房炎奶樣兩份。

1.1.2 培養(yǎng)基與生化試劑 LB肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基等各種生化試驗(yàn)用培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[1]配置，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；革蘭氏染液購自于貝索生物科技有限公司；細(xì)菌微量發(fā)酵管購自于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要器械 超凈工作臺(tái)(0066)，上海鴻都電子科技有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZHWY-2102C)，(上海智城分析儀器制造有限公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GH-600BC)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；4℃冰箱(BCD-209 S/D)，海信容聲冰箱有限公司產(chǎn)品；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(HVE-50/HV-25，HIRAYAMA)及實(shí)驗(yàn)室常用大小試管及平皿。

1.1.4 藥敏試驗(yàn) 氨芐西林(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩諾沙星(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、青霉素(10U/片)、鏈霉素(10 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、克林霉素(2 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、頭孢唑啉(30 μg/片)、呋喃妥因(300 μg/片)等藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 染色鏡檢 將奶樣涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌染色特性及形態(tài)特征。

1.2.2 分離培養(yǎng) 將乳樣搖勻后，取100 ul接種于LB肉湯中，置37℃搖床內(nèi)振蕩擴(kuò)增培養(yǎng)18～24 h后染色鏡檢，將擴(kuò)增后肉湯中的細(xì)菌分別在普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h后挑取典型的紅色單個(gè)菌落染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)及染色特性，后再次接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，18～24 h后觀察細(xì)菌形態(tài)，染色鏡檢對(duì)其鑒定，最后將已純化的細(xì)菌進(jìn)行保存。

1.2.3 生化鑒定 分離菌的生化鑒定，參照文獻(xiàn)[2-3]的方法進(jìn)行。將已分離純化的菌株進(jìn)行M.R、V-P、三糖鐵、檸檬酸鈉、吲哚、甘露醇、棉子糖、山梨醇、葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖等生化試驗(yàn)，觀察其生化反應(yīng)特性。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照趙占峰等[4]根據(jù)NCCLS(美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì))標(biāo)準(zhǔn)判定試驗(yàn)結(jié)果。將純化菌株在37 ℃營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18～24 h，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至濃度約為2×106個(gè)/mL，用無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。每個(gè)平板貼6張藥敏紙片為宜，兩紙片相距25 mm，紙片與平板邊緣10 mm～15 mm，并輕按紙片中心，使其附著嚴(yán)密，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。測(cè)量抑菌圈直徑，判定分離菌株對(duì)藥敏紙片的敏感性。

2 結(jié)果及分析

2.1 形態(tài)特征及培養(yǎng)特性

在37℃恒溫培養(yǎng)箱中經(jīng)24 h培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，分離菌菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色、表面濕潤(rùn)光滑、不透明、圓形的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上呈鮮桃紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，符合大腸桿菌特性(圖1)；挑選符合大腸桿菌生長(zhǎng)特性的菌落，革蘭氏染色鏡檢，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)兩端鈍圓的淡紅色短狀桿菌(圖2)；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成圓形、隆起、光滑且具有金屬光澤的菌落(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從兩份奶樣中兩株疑似大腸桿菌。

圖1 分離菌麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況

圖2 顯微鏡鏡檢結(jié)果

圖3 分離菌伊紅美藍(lán)培

2.2 生化鑒定結(jié)果

生化結(jié)果顯示，兩株分離菌的M.R反應(yīng)都變?yōu)榧t色為陽性；V-P反應(yīng)不變色為陰性；吲哚反應(yīng)變?yōu)榧t色為陽性；檸檬酸鈉反應(yīng)不變色為陰性；三糖鐵斜面能產(chǎn)氣、產(chǎn)酸，不生成H2S；能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、棉子糖、山梨醇和甘露醇,不同的是一株可以分解蔗糖，另一株不能分解蔗糖。該試驗(yàn)結(jié)果符合大腸桿菌的生化鑒定，生化特性鑒定結(jié)果見表1和表2。

表1 分離株1的生化反應(yīng)結(jié)果

注：“+”為產(chǎn)酸/陽性；“-”為不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣/陰性。

表2 分離株2的生化反應(yīng)結(jié)果

注：“+”為產(chǎn)酸/陽性；“-”為不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣/陰性。

2.3 藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離培養(yǎng)獲得的純化菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)氨芐西林和頭孢唑啉高度敏感；對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、克林霉素、慶大霉素、呋喃妥因中度敏感；對(duì)青霉素、阿莫西林、鏈霉素、四環(huán)素耐受。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

3 討論

本試驗(yàn)從采集的乳樣中分離出兩株細(xì)菌，通過分離培養(yǎng)結(jié)果、形態(tài)學(xué)觀察、生化特性分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，分離菌株為大腸桿菌。

隨著抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇壓力越來越大，許多大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性日益降低，耐藥菌株越來越多，各地所分離的大腸桿菌對(duì)抗生素的差異很大，目前很難確定一個(gè)能普遍使用的抗菌藥物敏感譜[5]。方光遠(yuǎn)[6]等(2010)從南京某規(guī)?；?chǎng)臨床性乳房炎患牛分離出的大腸桿菌對(duì)頭孢類抗生素高度敏感與本實(shí)驗(yàn)分離的大腸桿菌耐藥性基本相同，而對(duì)慶大霉素、鏈霉素低度敏感，與本實(shí)驗(yàn)分離的大腸桿菌的耐藥性有一定差異；朱少奇等[7](2011)從黑龍江黑河市周邊地區(qū)臨床型乳房炎分離出的大腸桿菌對(duì)青霉素與鏈霉素耐藥，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)大腸桿菌耐藥性高度一致。說明大腸桿菌早已對(duì)此類抗生素產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性；劉通等[8](2016)對(duì)黑龍江某規(guī)模化牛場(chǎng)致乳房炎大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)四環(huán)素高度敏感的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大差異。對(duì)于新疆，不同地域分離到的大腸桿菌耐藥性也會(huì)有所不同。覃杰等[9](2014)對(duì)新疆鐵門關(guān)地區(qū)(南疆)奶牛乳房炎大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示大腸桿菌對(duì)克林霉素高度敏感，對(duì)氨芐西林耐藥，這與本試驗(yàn)大腸桿菌耐藥性有所不同；賈林軍等[10](2014)對(duì)新疆昌吉地區(qū)(北疆)致奶牛乳房炎大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，顯示大腸桿菌對(duì)青霉素、慶大霉素、氨節(jié)西林中度敏感，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)藥敏結(jié)果有差異。

表3 分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果看，分離菌株對(duì)常規(guī)抗生素如阿莫西林、青霉素、鏈霉素等均產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，其可能是由于該奶牛場(chǎng)長(zhǎng)期使用上述常規(guī)抗生素或此菌株由牛場(chǎng)外傳入引起奶牛發(fā)病，在傳入之前已經(jīng)對(duì)上述常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性。因此在治療奶牛乳房炎大腸桿菌感染時(shí)，最好選用經(jīng)抗生素敏感試驗(yàn)確證為高效的藥物用于治療才能收到良好的效果[11]。建議牛場(chǎng)在防治大腸桿菌病時(shí)，對(duì)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果用2-3種敏感藥物按療程和足夠的劑量交替使用。

奶牛的飼養(yǎng)管理、牛舍及周圍環(huán)境、工作人員的操作以及擠奶器械消毒等環(huán)節(jié)的問題都將會(huì)導(dǎo)致奶牛乳房炎的發(fā)生。我們?cè)诓蓸又邪l(fā)現(xiàn)，該牛場(chǎng)選址離公路較近，在泌乳牛舍中刺鼻氣味重，捕蠅籠與糞污清理不及時(shí)，圈舍外糞便堆積地點(diǎn)和圈舍距離過近，這些因素都極有可能導(dǎo)致牛場(chǎng)奶牛乳房炎的發(fā)生。因此應(yīng)加強(qiáng)奶牛的飼養(yǎng)管理，改善牛舍及周圍環(huán)境衛(wèi)生，保持牛舍通風(fēng)干燥且定期清洗牛舍和對(duì)牛舍進(jìn)行滅菌消毒。此外要定期對(duì)奶牛進(jìn)行檢查，對(duì)久治不愈的臨床型乳房炎患牛應(yīng)淘汰[12]。同時(shí)應(yīng)規(guī)范擠奶程序，做好擠奶用具的消毒工作，防止擠奶過程中的微生物感染。

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