有機(jī)相脂肪酶催化合成山梨酸乙酯的研究

，， ，

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014)

山梨酸乙酯是一類新型的山梨酸衍生物，是一種國(guó)際公認(rèn)的低毒高效食品防腐劑，也是一種重要的農(nóng)藥增效劑[1].目前山梨酸乙酯的合成主要是化學(xué)合成法.湯健[2]報(bào)道了一種仿自然衍生法制取山梨酸乙酯原液，制備工藝較繁瑣，山梨酸乙酯得率為85%.鄧?yán)^勇等[3]研究了以氯化亞錫水合物為催化劑催化山梨酸乙酯的合成，山梨酸乙酯的分離處理復(fù)雜.梁紅冬等[4]報(bào)道了一種山梨酸乙酯的合成方法，反應(yīng)在110 ℃溫度條件下進(jìn)行，存在較大安全隱患.因此化學(xué)法合成反應(yīng)條件苛刻，存在副反應(yīng)多、設(shè)備腐蝕嚴(yán)重和后處理復(fù)雜等缺點(diǎn).酶催化法[5]利用酶對(duì)催化反應(yīng)的高度專一性，具有反應(yīng)條件溫和、節(jié)能環(huán)保和催化效率高等優(yōu)點(diǎn)，已顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景.

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又稱甘油酯水解酶，是一類特殊的酯鍵水解酶，能夠催化酯化、酯水解、醇解和轉(zhuǎn)酯化等多種反應(yīng)[6-8]，在油水界面可催化脂肪分解為甘油和脂肪酸，在非水介質(zhì)中則催化甘油和脂肪酸合成脂肪[9-10].脂肪酶具有界面活化現(xiàn)象，在油水界面的催化活性會(huì)得到顯著提高.在脂肪酶催化體系中，除了參與反應(yīng)的酶和底物外，反應(yīng)介質(zhì)也有影響[9].與傳統(tǒng)的水相酶催化相比，在近乎無(wú)水的有機(jī)相中的酶催化反應(yīng)，脂肪酶表現(xiàn)出優(yōu)異的催化作用.筆者首次利用脂肪酶催化山梨酸和乙醇合成山梨酸乙酯，對(duì)該催化反應(yīng)的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化研究.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固定化CandidaanatarcticB脂肪酶(Novozym 435)、固定化Rhizomucormiehei脂肪酶(Lipase RM IM)和Thermomyceslanuginosus脂肪酶(Lipase TL IM)購(gòu)于丹麥Novo Nordisk公司；Asperillusniger脂肪酶(A.nigerLipase)、Pseudomonasfauore脂肪酶(Lipase AK)、固定化Burkholderiacepacia脂肪酶(Lipase PS IM)購(gòu)于日本Amano公司；Aspergillusoryzae脂肪酶(A.oryzaeLipase)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心M206105；Penicilliumexpansum脂肪酶(P.expansumLipase)購(gòu)自深圳綠微康生物工程有限公司；山梨酸由寧波王龍科技股份有限公司贈(zèng)送；山梨酸乙酯購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司；4A分子篩、無(wú)水乙醇、正己烷、乙酸乙酯等化學(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

臺(tái)式恒溫水浴搖床(M1248-0003，美國(guó)NBS公司)；氣相色譜儀(Agilent 6890N，美國(guó)安捷倫科技公司)；電子分析天平(PB203-N，上海世義精密儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山梨酸乙酯的合成

在25 mL具塞反應(yīng)瓶中，將1.0 mmol乙醇和0.5 mmol山梨酸溶解于5 mL有機(jī)溶劑中，混勻后加入50 mg脂肪酶粉.在搖床上以150 r/min轉(zhuǎn)速，37 ℃反應(yīng)10 h后取出部分樣品進(jìn)行檢測(cè).其反應(yīng)式為

1.2.2 反應(yīng)過(guò)程的色譜分析

酶催化反應(yīng)過(guò)程通過(guò)氣相色譜儀分析.取反應(yīng)液100 μL，用環(huán)己烷稀釋至測(cè)定范圍進(jìn)行分析，色譜柱HP-5(30 m×0.32 mm，0.25 μm)、載氣(N2)流速2.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度220 ℃，分流比20∶1；柱箱溫度120 ℃，恒溫保持2 min，以10 ℃/min 的速率上升到150 ℃，恒溫保持6 min.采用氫離子火焰檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度250 ℃；山梨酸乙酯保留時(shí)間為4.1 min.

1.2.3 反應(yīng)得率的測(cè)定

山梨酸乙酯摩爾分?jǐn)?shù)測(cè)定后，算出其摩爾濃度.反應(yīng)得率=(山梨酸乙酯摩爾濃度/山梨酸初始摩爾濃度)×100%.

1.2.4 產(chǎn)物的質(zhì)譜分析方法

GC-MS分析條件(Agilent 7890N/5975C)：氣相色譜柱型號(hào)HP-5 MS，進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比50∶1；柱流速1 mL/min；柱溫箱溫度100 ℃保留3 min，10 ℃/min升溫至200 ℃保留5 min；輔助加熱區(qū)溫度250 ℃；MS四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃.EI+轟擊源，全掃描模式掃描，掃描質(zhì)量范圍30～500 amu，發(fā)射電流200 μA，電子能量70 eV.

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

筆者考察了Novozym 435，Lipase RM IM，Lipase TL IM，Lipase AK，A.nigerLipase，P.expansumLipase，A.oryzaeLipase和Lipase PS IM脂肪酶等8 種不同來(lái)源脂肪酶對(duì)該反應(yīng)的催化效果，結(jié)果見(jiàn)表1.根據(jù)表1中數(shù)據(jù)可以看出：Novozym 435脂肪酶具有催化合成山梨酸乙酯活力，轉(zhuǎn)化率達(dá)到8.7%，因此確定山梨酸乙酯合成反應(yīng)催化劑為Novozym 435.

表1 脂肪酶催化反應(yīng)的篩選Table 1 Screening of lipase for the synthesis of ethyl sorbate

2.2 有機(jī)溶劑的影響

有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)對(duì)底物的相對(duì)溶解度、酶的催化活性和穩(wěn)定性有一定的影響，而酶的催化活性與溶劑的疏水性大小(logP)有很大關(guān)系[11].在一定程度上可以作為溶劑極性的定量表達(dá)，logP值越高，溶劑的疏水性越強(qiáng)，對(duì)酶催化的影響也越小[12].為了確定反應(yīng)的最適反應(yīng)介質(zhì)，以Novozym 435脂肪酶催化反應(yīng)，分別以環(huán)己烷、異辛烷、叔丁醇、甲基叔丁基醚、1,4-二氧六環(huán)、甲苯和二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑進(jìn)行考察，它們的疏水性如表2所示(有機(jī)溶劑在25 ℃時(shí)的logP值數(shù)據(jù)來(lái)源于SciFinder Scholar).有機(jī)溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響如圖1所示，可得出Novozym 435在叔丁醇、環(huán)己烷和異辛烷有機(jī)溶劑中催化活性較高，表明酶催化活性與溶劑疏水性參數(shù)logP有一定相關(guān)性，但并無(wú)必然關(guān)聯(lián).其中叔丁醇中得率最高，故選取叔丁醇作為反應(yīng)溶劑做下一步實(shí)驗(yàn).

表2 有機(jī)溶劑及其logP值Table 2 Organic solvents and their logP

1—環(huán)已烷；2—異辛烷；3—叔丁醇；4—甲基叔丁基醚；5—1， 4-二氧六環(huán)；6—甲苯；7—二氯甲烷圖1 不同有機(jī)溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of various solvents on the enzymatic catalytic reaction

2.3 底物摩爾比對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

通過(guò)控制反應(yīng)底物的摩爾比，可以改變反應(yīng)速率來(lái)縮短反應(yīng)所需時(shí)間，且降低下游提取工藝難度[13-14].脂肪酶催化的酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，過(guò)多的乙醇加入使體系的山梨酸和脂肪酶濃度降低[15]，從而降低山梨酸乙酯的得率，因此有必要通過(guò)對(duì)幾種不同底物摩爾比進(jìn)行比較來(lái)確定最佳底物摩爾濃度比例.在叔丁醇反應(yīng)體系中，以Novozym 435脂肪酶催化反應(yīng)，用不同底物濃度比例反應(yīng)的結(jié)果如圖2所示，在n(乙醇)∶n(山梨酸)<5∶1時(shí)，山梨酸乙酯的得率隨著比例的提高而升高，當(dāng)?shù)孜锬柋葹?∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大為46.3%，故選用5∶1的比例進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

圖2 底物摩爾比對(duì)酶催化反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of substrate molar ratio on the enzymatic catalytic reaction

2.4 分子篩種類對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

在脂肪酶的酯化反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)體系中的含水量會(huì)直接影響反應(yīng)速率及反應(yīng)平衡.水是維持脂肪酶活力的必需物質(zhì)，含水量過(guò)低會(huì)降低酶的催化活性，含水量過(guò)高則破壞反應(yīng)化學(xué)平衡，抑制反應(yīng)平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng)[16-17]，從而降低得率.因此反應(yīng)體系中適宜的含水量對(duì)脂肪酶的催化反應(yīng)中提高底物的轉(zhuǎn)化率具有重要的意義.本實(shí)驗(yàn)叔丁醇反應(yīng)體系中，以Novozym 435脂肪酶催化反應(yīng)，n(乙醇)∶n(山梨酸)=5∶1，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入不同種類及不同濃度的分子篩來(lái)改變反應(yīng)體系中的水分[18]，以考察含水量對(duì)山梨酸乙酯得率的影響，結(jié)果如圖3所示.結(jié)果表明：當(dāng)反應(yīng)體系中加入4A分子篩及添加比例為1∶10時(shí)，山梨酸乙酯得率最大為79.6%.

1—4A 1∶5；2—5A 1∶5；3—4A 1∶10；4—5A 1∶10； 5—4A 1∶15；6—5A 1∶15圖3 分子篩種類對(duì)酶催化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of zeolite on the enzymatic catalytic reaction

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)得出溫度升高，反應(yīng)速度加快[19].但過(guò)高的溫度會(huì)破壞酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低反應(yīng)速率，同時(shí)溫度的改變對(duì)于有機(jī)溶劑黏度的影響也會(huì)影響轉(zhuǎn)化率.因此最優(yōu)反應(yīng)溫度的考察就顯得十分必要.在叔丁醇反應(yīng)體系中，利用Novozym 435脂肪酶催化反應(yīng)，n(乙醇)∶n(山梨酸)=5∶1，添加4A分子篩比例為1∶10，不同溫度條件進(jìn)行酶催化反應(yīng)的結(jié)果如圖4所示.轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高而升高，但超過(guò)60 ℃后，酶蛋白在高溫下逐漸失活，影響了催化反應(yīng)，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率降低.因此最佳反應(yīng)溫度選擇為60 ℃，此時(shí)山梨酸乙酯得率可達(dá)97.4%.

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the enzymatic catalytic reaction

2.6 酶催化反應(yīng)的時(shí)間曲線

在以上最佳單因素優(yōu)化后的條件下進(jìn)行酶催化試驗(yàn)，不同反應(yīng)時(shí)間后取樣檢測(cè)山梨酸乙酯，比較山梨酸乙酯得率，結(jié)果見(jiàn)圖5.由圖5得出：隨酶催化時(shí)間的增長(zhǎng)，反應(yīng)得率不斷升高，當(dāng)酶催化反應(yīng)進(jìn)行10 h后，反應(yīng)得率增加減緩，可能由于反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的山梨酸乙酯大量積累后水解速率增加，導(dǎo)致酯化反應(yīng)和水解反應(yīng)達(dá)到平衡.因此，該酶催化反應(yīng)選擇反應(yīng)時(shí)間為10 h，此時(shí)得率可達(dá)97.4%.

圖5 酶催化反應(yīng)的時(shí)間曲線Fig.5 Time course of enzyme-catalyzed reaction

2.7 產(chǎn)物的表征結(jié)果分析

酶催化反應(yīng)合成得到的山梨酸乙酯利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，得到產(chǎn)物的氣相質(zhì)譜圖(圖6).根據(jù)質(zhì)譜圖推測(cè)該產(chǎn)物為山梨酸乙酯，其中m/z=140.1為山梨酸乙酯的分子離子峰.

圖6 山梨酸乙酯的GC-MS質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrometry of ethyl sorbate

3 結(jié) 論

利用脂肪酶催化以山梨酸和乙醇為原料合成了重要的低毒高效食品防腐劑山梨酸乙酯，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)該催化反應(yīng)的影響因素(反應(yīng)溶劑、溫度和底物摩爾比等)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化研究，確定了最佳合成工藝條件：脂肪酶Novozym 435作為催化劑，叔丁醇為反應(yīng)溶劑，n(乙醇)∶n(山梨酸)=5∶1，吸水劑4A分子篩添加量10%，反應(yīng)溫度60 ℃，當(dāng)反應(yīng)10 h后山梨酸乙酯得率可達(dá)到97.4%，產(chǎn)物經(jīng)氣相質(zhì)譜(GC/MS)結(jié)構(gòu)鑒定.構(gòu)建了一條酶法合成山梨酸乙酯的綠色工藝路線，為進(jìn)一步商業(yè)化開(kāi)發(fā)和綠色生產(chǎn)山梨酸乙酯提供良好的理論和實(shí)踐基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)：

[1] 何建真，王健燕，陳競(jìng)宇.山梨酸乙酯制備方法及其應(yīng)用[J].廣西化工，1998，27(2)：30-32.

[2] 湯健.山梨酸乙酯原液的生產(chǎn)方法：中國(guó)，99112561.4[P].2001-05-23.

[3] 鄧?yán)^勇，周原，王煥龍.山梨酸乙酯的非酸催化合成[J].廣西化工，2000，29(3)：7-10.

[4] 梁紅冬，陳建，范偉婷.山梨酸乙酯的合成研究[J].廣東石油化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，23(1)：67-72.

[5] 段章群，杜偉，劉德華.生物酶法制備1,3-甘油二酯[J].化學(xué)進(jìn)展，2009，21(9)：1939-1944.

[6] KRETZA E, PAPANEOPHYTOU C, PAPI R, et al. Lipase activity inThermusthermophilusHB8: purification and characterization of the extracellular enzyme[J]. Biotechnology and bioprocess engineering,2012,34(17):512-525.

[7] 馬玲芝，錢俊青.離子交換樹(shù)脂固定化脂肪酶催化合成蔗糖乙酯[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40(1)：21-24.

[8] 錢俊青，蔣盛藍(lán)，秦德懷，等.214型離子交換樹(shù)脂固定化假絲酵母脂肪酶的研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，41(3)：244-247.

[9] ZAKS A, KLIBANOV M. Enzyme catalyzed processes in organic media at 100 ℃[J]. Abstracts of papers of the American chemical society,1984,81(188):1249-1251.

[10] SALWA KARBOUNE, MOHAMMAD SAFARI, BENA-MARIE LUE, et al. Lipase-catalyzed biosynthesis of cinnamoylated lipids in a selected organic solvent medium[J]. Journal of biotechnology,2005,119(156):281-290.

[11] 彭立鳳.有機(jī)溶劑對(duì)酶催化活性和選擇性的影響[J].化學(xué)進(jìn)展，2000，12(3)：103-105.

[12] 姚俠，鄭建永，應(yīng)向賢，等.有機(jī)相脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯[J].生物加工過(guò)程，2012，10(3)：12-16.

[13] 杜理華，徐亮亮，成柄灼.一種脂肪酶催化柚皮苷酯化反應(yīng)的研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，42(6)：627-631.

[14] 黃志良，戰(zhàn)宇，寧正祥，等.山梨酸酯的合成與抗菌作用研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(3)：84-86.

[15] 黃小華，胡益民，王修然.山梨酸乙酯的制備[J].安微機(jī)電學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，14(4)：19-22.

[16] 王召賀，張?jiān)?，孫愛(ài)君，等.一種深海微生物脂肪酶在非水介質(zhì)中催化合成乙酸肉桂酯的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技，2016，9(1)：202-206.

[17] 孫平，卜慶珍，唐小華，等.脂肪酶催化麥芽糖硬脂酸酯合成的研究[J].中國(guó)食品添加劑，2009(2)：108-111.

[18] 王曉梅，張建榮.分子篩脫除碳酸酯中微量水的應(yīng)用研究[J].河北化工，2012，35(10)：78-80.

[19] 閆倩云，李玲玲，叢方地，等.固定化脂肪酶生物反應(yīng)器催化合成乙酸正己酯[J].食品工業(yè)科技，2015，36(9)：171-174.