重組雞GSTA3蛋白對(duì)福美雙誘導(dǎo)脛骨軟骨發(fā)育不良肉雞紅細(xì)胞免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

賈發(fā)杰，牛 勝，張 寧，李 欣，寧官保，張 鼎，李宏全，馬海利，郝衛(wèi)芳，高文偉，趙宇軍，高詩(shī)敏，李桂蘭，李建慧，閆 芳，高榮琨，田文霞*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801； 2.太原市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，太原 030024)

肉雞TD是一種家禽脛骨近端生長(zhǎng)板成骨受阻的疾病[1]。TD可導(dǎo)致肉雞骨變形[2]，該病嚴(yán)重危害了肉雞養(yǎng)殖業(yè)，導(dǎo)致TD的因素很多，其致病機(jī)制還不清楚，也沒有有效的預(yù)防措施。福美雙是一類二硫代氨基甲酸酯相關(guān)化合物，不但被廣泛的用作種子處理農(nóng)用殺菌劑，而且在橡膠工業(yè)中被較小范圍的用作促進(jìn)劑[3]。雞慢性接觸二硫代氨基甲酸酯殺蟲劑，例如福美雙或戒酒硫，會(huì)增加TD發(fā)病率[4-5]。福美雙能有效地誘發(fā)肉雞TD，并且與自然發(fā)生的肉雞TD在癥狀上十分相似[6]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GSTs)是Ⅱ相抗氧化家族中的一類蛋白酶，且有解毒的作用[7]。相關(guān)研究表明，GSTA3在保護(hù)正常的小鼠抵抗黃曲霉毒素毒性中起重要作用[8]。患有TD的肉雞生長(zhǎng)板的很多軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-10]。受到刺激的TLRs 能夠通過(guò)引發(fā)促凋亡信號(hào)通路而誘導(dǎo)凋亡[11-13]。相關(guān)研究表明，雞紅細(xì)胞不但具有免疫功能而且可以表達(dá)TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7[14]。田文霞(W.X.Tian)等利用微陣列芯片技術(shù)篩選出TD早期的肉雞脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)差異性表達(dá)的免疫相關(guān)基因[15]。先前人們主要從生長(zhǎng)板血管的生成、生長(zhǎng)板細(xì)胞的代謝、成熟和凋亡方面研究了TD的發(fā)生機(jī)制[16-18]，但是紅細(xì)胞免疫功能和chGSTA3蛋白解毒作用對(duì)TD發(fā)生的影響尚未見報(bào)道。為研究福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞中紅細(xì)胞免疫基因的轉(zhuǎn)錄變化和重組chGSTA3對(duì)TD肉雞紅細(xì)胞免疫基因mRNA 水平的影響，我們對(duì)福美雙處理組肉雞飼喂100 mg·kg-1福美雙建立TD模型，并在不同的時(shí)間利用chGSTA3對(duì)TD肉雞進(jìn)行腿部肌肉注射，使用Real-time PCR檢測(cè)TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、IL-7、MyD88、TRAF6、MHCⅡ和NLRC5轉(zhuǎn)錄水平的變化，以探明其在肉雞TD中的作用以及chGSTA3在TD發(fā)生時(shí)對(duì)它們的影響，為更深入全面的了解TD的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防TD的發(fā)生提供新的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1日齡120只健康艾維茵肉雛雞購(gòu)自山西省大象農(nóng)牧集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

福美雙(Amresco)；實(shí)驗(yàn)室自行制備的重組雞GSTA3純化蛋白[19]；RNAiso plus(Trizol)(AA909-1)；prime script TM RT Reagent Kit(AK3020)；SYBR?Premix ExTaqⅡ(TaKaRa大連寶生物工程有限公司)；DEPC購(gòu)于Amresco公司；6× DNA Loading Buffer，600 bp DNA ladder(中科瑞泰生物科技有限公司)；50× TAE Buffer(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；2 mL、1.5 mL 離心管(Axygen)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物處理 將飼喂一周后的120只肉雛雞隨機(jī)分為基礎(chǔ)日糧組(A、B、C組)和飼喂福美雙組(D、E、F組)。參考田文霞等[20-21]試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案構(gòu)建肉雞TD模型；通過(guò)肌肉注射，在肉雞第8、10、12、14日齡時(shí)，分別給B、E組肉雞腿部注射濃度為20 μg·kg-1的重組chGSTA3蛋白；給C、F組肉雞腿部注射50 μg·kg-1的重組chGSTA3蛋白；給A、D組肉雞注射等體積的PBS，對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行常規(guī)的飼養(yǎng)管理。在飼喂福美雙后第4和15天，對(duì)各組雞每只采集靜脈抗凝血2 mL，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 雞紅細(xì)胞分離和紅細(xì)胞RNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 參照相關(guān)文獻(xiàn)從上述血液樣品中分離紅細(xì)胞[14]，使用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的Trizol法提取紅細(xì)胞總RNA，用核酸測(cè)定儀測(cè)定提取的RNA的濃度、A260/280、A260/230的值，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的紅細(xì)胞RNA的質(zhì)量。對(duì)質(zhì)量合格的RNA反轉(zhuǎn)錄，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI收錄的免疫相關(guān)的基因IL-7、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7、TLR15、NLRC5的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)其引物，參考相關(guān)文獻(xiàn)[22-24]得到TLR4、MyD88、MHCⅡ、TRAF6基因的引物序列，利用18S rRNA作為內(nèi)參基因。由上海捷瑞生物工程有限公司合成本試驗(yàn)所用引物(表1)。

表1Real-timePCR擴(kuò)增所使用的引物序列及GenBank登錄號(hào)

Table1PrimersequencesandGenBankaccessionnumbersusedintheReal-timePCRanalysis

基因Gene引物序列(5'→3')PrimersequencesGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionnumberMHCⅡF:TGCCCGAAACCGACCGTCTGNM001318995R:TCCAGCACCACCAGCACCTGMyD88F:CAGAAAGACCTTCAGTTTGTCCAGNM001030962R:AATGACGACCACCATCCTCCTRAF6F:ATGGAAGCCAAGCCAGAGTTXM015287208R:ACAGCGCACCAGAAGGGTATTLR2F:ACCTGGCCCATAACAGGATAAB046119R:ATGGAGCTGATTTGGTTGGATLR3F:GCCTAAATATCACGGTACTCNM_001011691R:CACAACAGTGGTAGTGATCATLR4F:AGTCTGAAATTGCTGAGCTCAAATNM001030693R:GCGACGTTAAGCCATGGAAG

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

F.上游引物；R.下游引物

F. Forward primers; R. Reverse primers

1.3.4 Real-time PCR檢測(cè)肉雞紅細(xì)胞IL-7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MyD88、MHCⅡ、NLRC5和TRAF6基因 根據(jù)SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，采用10 μL的反應(yīng)體系，體系組成:0.25 μL的上游和下游引物(10 μmol·L-1)，5.0 μL SYBR Premix ExTaqⅡ(2×)，0.1 μL ROX Refe-rence DyeⅡ(50×)，1.0 μL RT反應(yīng)液，3.4 μL單蒸水(dH2O)；Real-time PCR條件：預(yù)變性反應(yīng)1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 3 min，PCR反應(yīng)42個(gè)循環(huán)，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s；熔解曲線分析1個(gè)循環(huán)，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 用2-△△Ct法計(jì)算免疫相關(guān)基因在雞紅細(xì)胞中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量，使用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析各組數(shù)據(jù)的差異顯著性，P<0.05即為差異表達(dá)顯著，P>0.05表達(dá)不顯著；各組間顯著差異標(biāo)注不同英文小寫字母。

2 結(jié) 果

2.1 IL-7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MyD88、MHCⅡ、NLRC5和TRAF6在肉雞紅細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

試驗(yàn)結(jié)果表明正常肉雞紅細(xì)胞能夠在mRNA水平上表達(dá)IL-7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MyD88、MHCⅡ、NLRC5和TRAF6，其中TLR7表達(dá)量最高，其次是IL-7、TLR5、TLR4、TLR2、TLR3、TLR15、MyD88，而MHCⅡ、NLRC5、TRAF6表達(dá)量較低，見圖1。

圖1 在正常肉雞紅細(xì)胞中TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MyD88、MHCⅡ、TRAF6、IL-7、NLRC5相對(duì)于內(nèi)參基因18S的mRNA表達(dá)量Fig.1 The mRNA expression level of TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR15, MyD88, MHCⅡ, TRAF6, IL-7, NLRC5 in erythrocytes of healthy broiler chickens relative to reference gene 18S

2.2 TD肉雞紅細(xì)胞中免疫相關(guān)基因mRNA水平變化及chGSTA3對(duì)TD肉雞紅細(xì)胞中免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

通過(guò)Real-time PCR對(duì)TD肉雞紅細(xì)胞免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在TD損傷期的第4天，D組與A組相比，雞紅細(xì)胞中的TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MyD88、MHCⅡ、NLRC5、TRAF6基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，IL-7顯著降低(P<0.05)；在飼喂福美雙后第15天，D組TD肉雞紅細(xì)胞中TLR2、TLR4、MyD88和NLRC5顯著下調(diào)(P<0.05)，IL-7、TLR3、TLR5、TLR7、TLR15、MHCⅡ和TRAF6變化不顯著(P>0.05)。chGSTA3處理的E組和F組與D組相比，在試驗(yàn)第4天，除了E組中的TLR4、TLR5、MyD88，其余基因都發(fā)生了顯著變化(P<0.05)，在第15天E組中的TLR4、TLR5、MyD88、NLRC5及F組中的TLR3、TLR5、MyD88、TRAF6、IL-7變化不顯著，其余基因都有顯著差異(P<0.05)，見圖2。

A. PBS組；B. 20 μg·kg-1 chGSTA3組；C. 50 μg·kg-1 chGSTA3組；D. 100 mg·kg-1福美雙+PBS組；E. 100 mg·kg-1福美雙和20 μg·kg-1 chGSTA3組；F. 100 mg·kg-1福美雙+50 μg·kg-1 chGSTA3組；不同的小寫字母(例如a、b、c、d、e、f)表示各組間差異顯著(P<0.05)A. PBS group; B. chGSTA3 20 μg·kg-1 group; C. chGSTA3 50 μg·kg-1 group; D. Thiram 100 mg·kg-1+PBS group; E. Thiram 100 mg·kg-1 + chGSTA3 20 μg·kg-1 group; F. Thiram 100 mg·kg-1 + chGSTA3 50 μg·kg-1 group; Different lower-case letters (such as a, b, c, d, e, f) indicate the significant difference between groups (P<0.05)圖2 TD肉雞紅細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化及chGSTA3對(duì)其的影響Fig.2 The transcription level of immune related genes in erythrocytes of TD affected-broiler chickens and the effection of recombinant chGSTA3 on the transcription

3 討 論

田文霞等研究發(fā)現(xiàn)，肉雞TD的發(fā)生可能與福美雙影響GSTs的解毒功能有關(guān)[25-26]，同時(shí)利用cDNA芯片技術(shù)篩選出1 630個(gè)差異表達(dá)基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析，這些基因與免疫應(yīng)答、抗凋亡和氧化應(yīng)激等都有關(guān)[15]。本試驗(yàn)對(duì)肉雞TD紅細(xì)胞中免疫基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)注射重組chGSTA3蛋白后，IL-7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MHCⅡ、MyD88、NLRC5、TRAF6有差異，表明chGSTA3在福美雙誘導(dǎo)的肉雞TD中發(fā)揮一定的作用，但其作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。研究表明，福美雙能改變神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)，從而使其凋亡[27]；N. C. Rath等[16]和張寧等[17]通過(guò)TUNEL法檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)TD肉雞脛骨生長(zhǎng)板內(nèi)許多軟骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終導(dǎo)致TD發(fā)生。

有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體細(xì)胞中的TLR3基因被激活后，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活核因子κB(NF-κB)，使有生物活性的細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)被大量生成和釋放，導(dǎo)致干擾素等蛋白的活化，進(jìn)而使感染病毒的細(xì)胞發(fā)生凋亡[28]，而卡介苗能通過(guò)活化TLR7而引起淺表膀胱癌細(xì)胞的凋亡[29]；雞紅細(xì)胞也可能通過(guò)上調(diào)IFNs 的表達(dá)，促進(jìn)病毒感染的細(xì)胞凋亡[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在試驗(yàn)第4天，飼喂福美雙D組TLR3和TLR7顯著上調(diào)，可能使軟骨細(xì)胞凋亡，而誘導(dǎo)TD發(fā)生[17]。

研究表明，鞭毛蛋白誘導(dǎo)活化的TLR5也能導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡[30]，銀納米顆粒通過(guò)TLR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也會(huì)引起軟骨細(xì)胞的凋亡[31]，活化的TLR4-MyD88信號(hào)通路也參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的凋亡過(guò)程[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在試驗(yàn)第4天D組TLR2、TLR4和TLR5與A組相比顯著上調(diào)，可能通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活caspases信號(hào)通路，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡。

白細(xì)胞介素7能通過(guò)使促凋亡蛋白Bad失活而促進(jìn)T細(xì)胞的存活[33]。本研究顯示，在飼喂福美雙后第4天，IL-7基因顯著下調(diào)，可能在TD發(fā)生中也有促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡的作用。

在試驗(yàn)第15天，D組與對(duì)照組A相比，IL-7、MHCⅡ、TRAF6、TLR3、TLR5、TLR7、TLR15不顯著，MyD88、NLRC5、TLR2、TLR4下調(diào)，這可能與減輕軟骨損傷有關(guān)。

4 結(jié) 論

雞紅細(xì)胞能轉(zhuǎn)錄IL-7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MHCⅡ、MyD88、NLRC5、TRAF6；雞紅細(xì)胞TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MHCⅡ、MyD88、NLRC5、TRAF6基因mRNA水平升高，IL-7降低后，可能通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，而在后期可減輕TD癥狀；chGSTA3可改變紅細(xì)胞免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這將為預(yù)防TD和深入研究其發(fā)病機(jī)制提供理論支持。

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