寶坻大蒜HPLC化學(xué)指紋圖譜構(gòu)建

尚云濤 ，任春雪 ，王寧寧 ，徐李薇 ，范寶莉 ，陳 宏 ，王振英

（1.天津師范大學(xué)天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；3.天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

大蒜（Allium sativum L.）屬百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）2年生草本植物，在我國已有超過2000年的栽培歷史，我國也是當(dāng)前大蒜種植面積及產(chǎn)量最多的國家之一.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，大蒜具有抗氧化、防癌、保肝、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及降低心腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險等功效[1-2].大蒜提取物也被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的動物疾病防治以及農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮等領(lǐng)域[3-4].大蒜富含對人體有益的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素、鋅、鐵、硒等多種微量元素、多種含硫化合物如蒜氨酸以及次級產(chǎn)物大蒜素等[5].

化學(xué)指紋圖譜是在DNA指紋圖譜概念基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，目前主要用于中藥材的種屬鑒定、植物分類研究和產(chǎn)品品質(zhì)管理等.高效液相色譜技術(shù)（HPLC）是出現(xiàn)最早、也是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)指紋圖譜分析方法[6].如李婷婷等[7]建立了黃芪的HPLC指紋圖譜，共確定15個共有峰，樣品相似度在0.9以上，并對黃酮類成分的含量進(jìn)行了定量分析.張茹萍等[8]建立了雷公藤藥材的HPLC指紋圖譜，并利用主成分分析法評價了不同產(chǎn)地雷公藤的藥材質(zhì)量.馮旭等[9]利用HPLC技術(shù)建立了不同品種芒果葉片水提取物的HPLC指紋圖譜，共確定9個共有峰，并根據(jù)聚類分析結(jié)果將31個品種芒果分為3大類.近年來，有研究者建立了大蒜的HPLC指紋圖譜并應(yīng)用于大蒜及其制劑質(zhì)量控制[10-11]，結(jié)果證實指紋圖譜技術(shù)方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可以很好地評價、控制大蒜及其制劑質(zhì)量.目前報道所涉及的大蒜產(chǎn)地主要有新疆、山東、河南、云南、甘肅、遼寧等地區(qū)，缺乏天津?qū)氎娲笏獾臄?shù)據(jù).天津?qū)氎娲笏狻傲昙t”作為國家地理標(biāo)志性特色農(nóng)作物，特色鮮明，如蒜皮多為紫紅色，蒜頭通常4或6瓣，單柱型圍座，無加楔，無重瓣，致密堅硬，具有成熟早、耐寒、耐干旱、耐貯藏等優(yōu)良農(nóng)藝性狀.寶坻大蒜蒜瓣潔白脆嫩、風(fēng)味濃郁、辛辣多汁、口感極佳，蒜瓣搗爛后粘稠度高，不易變質(zhì)，是重要的天然植物粘合劑[12]，深受國內(nèi)外消費者青睞.因此許多外地大蒜因形似而冒充寶坻大蒜，以次充好，擾亂了市場秩序.

本研究利用高效液相色譜技術(shù)，構(gòu)建天津?qū)氎娲笏獾腍PLC化學(xué)指紋圖譜，為寶坻大蒜“六瓣紅”的質(zhì)量控制和評價提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：寶坻“六瓣紅”大蒜，采自天津?qū)氎鎱^(qū)大蒜種植基地.

試劑：二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚對照品，美國Sigma試劑公司；甲醇（色譜純），德國Merck公司；C18固相萃取小柱（500 mg，3 mL），美國Supelco公司.其余試劑均為分析純.

1.2 儀器

1200型高效液相色譜儀（配有二元泵、在線真空脫氣系統(tǒng)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Chem Station工作站），美國Agilent公司；固相萃取儀，美國Supelco公司.

1.3 色譜體系

Eclipse Plus C18，5 μm，4.6 mm × 250 mm.保護(hù)柱為：Eclipse Plus C18 Grd，5 μm；4.6 mm ×12.5 mm，柱溫35℃，流動相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液（體積比為4∶1），流速為1 mL/min，DAD檢測波長為240 nm，進(jìn)樣量為50 μL，檢測時間20 min.

1.4 對照品制備

準(zhǔn)確稱取二烯丙基二硫醚30.44 mg和二烯丙基三硫醚32.12 mg，溶于甲醇中定容至50 mL，再吸取上述混合溶液1 mL，用甲醇定容至10 mL作為對照品.

1.5 供試品溶液制備

稱取大蒜鱗莖20 g，破碎、研磨，加入25～30 mL蒸餾水，50～55℃溫浴酶解1 h，加甲醇定容至50 mL，5 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，作為待測溶液.C18固相萃取小柱經(jīng)5 mL甲醇、10 mL超純水活化后，平衡15 min.將待測溶液以4 mL/min的速率過柱，再用5 mL超純水淋洗，低真空（-60 kPa）抽干；再由5 mL甲醇洗脫后，室溫下低流速氮氣濃縮至0.5～0.8 mL，再以甲醇定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液.

1.6 樣品測定

按1.5方法制備10批次寶坻“六瓣紅”大蒜供試品溶液，按1.3色譜體系進(jìn)行測定，記錄色譜圖.

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用國家藥典委員會編寫的《中藥色譜指紋圖譜相似度系統(tǒng)2004A》軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度分析

取同一批次寶坻“六瓣紅”大蒜供試品溶液，按1.3色譜體系連續(xù)進(jìn)樣5次，考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果如表1和表2所示.由表1和表2可以看出，寶坻大蒜高效液相色譜分析共得到14個色譜峰，5次進(jìn)樣所有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于1.0%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)（RSD＜3.0%），表明儀器精密度良好，符合化學(xué)指紋圖譜的精密度要求.

表1 精密度實驗結(jié)果（保留時間）Tab.1 Results of precision experiment（retention time）min

表2 精密度實驗結(jié)果（峰面積）Tab.2 Results of precision experiment（peak area）mAU·min

2.1.2 穩(wěn)定性分析

取同一批次寶坻“六瓣紅”大蒜供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按第1.3節(jié)色譜體系連續(xù)進(jìn)樣檢測，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果如表3和表4所示.由表3和表4可以看出，在連續(xù)24 h的進(jìn)樣檢測中，14個色譜峰的相對保留時間RSD最大值為1.04%，相對峰面積的RSD最大值為1.48%，均小于2.0%.表明寶坻大蒜樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果（保留時間）Tab.3 Results of stability experiment（retention time）min

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果（峰面積）Tab.4 Results of stability experiment（peak area）mAU·min

2.1.3 重復(fù)性實驗

取同一批次寶坻“六瓣紅”大蒜制備成5份供試品溶液，按第1.3節(jié)色譜體系連續(xù)進(jìn)樣檢測，考察色譜峰的保留時間和峰面積，結(jié)果如表5和表6所示.由表5和表6可以看出，各色譜峰的保留時間RSD最大值為0.89%，峰面積RSD最大值為1.50%，均小于2.0%，表明體系的重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)性要求.

表5 重復(fù)性實驗結(jié)果（保留時間）Tab.5 Results of repetitive experiment（retention time）min

表6 重復(fù)性實驗結(jié)果（峰面積）Tab.6 Results of repetitive experiment（peak area）mAU·min

2.2 寶坻“六瓣紅”大蒜HPLC指紋圖譜的特征峰

根據(jù)不同批次寶坻“六瓣紅”大蒜樣品的HPLC圖譜數(shù)據(jù)，采用藥典委員會編寫的《中藥色譜指紋圖譜相似度系統(tǒng)2004A》軟件，生成的共有模式對照指紋圖譜如圖1所示，10批次大蒜樣品的化學(xué)指紋圖譜如圖2所示，對照品色譜峰如圖3所示.

圖1 寶坻大蒜HPLC對照指紋圖譜Fig.1 Control HPLC chromatogram of Baodi garlic

圖2 寶坻“六瓣紅”大蒜樣品指紋圖譜Fig.2 Overlapped HPLC fingerprint chromatogram of ten batches of Baodi garlic samples

圖3 對照品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of control substance

對10批次寶坻“六瓣紅”大蒜的HPLC指紋圖譜檢測結(jié)果進(jìn)行分析，共確定14個共有峰，其保留時間分別為：2.243、2.991、3.423、3.871、4.731、5.993、6.629、7.168、8.151、9.295、10.824、13.344、15.650、18.723 min，共有峰占總峰面積的90%以上，經(jīng)過與對照品進(jìn)行比較，第10、12號峰分別鑒定為二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚.選擇第10號峰（二烯丙基二硫醚）為內(nèi)參比峰.由圖2可以看出，10批次樣品化學(xué)指紋圖譜的相似度極高，且與對照指紋圖譜相似.

2.3 寶坻大蒜HPLC指紋圖譜的相似度評價

分別根據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度系統(tǒng)2004A》軟件和夾角余弦法計算不同批次寶坻“六瓣紅”大蒜樣品相似度，結(jié)果如表7和表8所示.由表7和表8可以看出，根據(jù)軟件和夾角余弦法計算的10批次寶坻大蒜樣品相似度良好，均大于0.99，符合指紋圖譜的的要求，可建立共有模式[13].

表7 10批次寶坻“六瓣紅”大蒜HPLC指紋圖譜相似度計算結(jié)果Tab.7 Similarity of the HPLC fingerprint of ten batches of the Baodi garlic

表8 10批次寶坻“六瓣紅”大蒜HPLC指紋圖譜夾角余弦法相似度計算結(jié)果Tab.8 Similarity of the HPLC fingerprint of ten batches of the Baodi garlic using Cosine method

3 結(jié)論

為了有效評價、控制寶坻大蒜的質(zhì)量，科學(xué)鑒別寶坻大蒜，本研究采用高效液相色譜法并利用固相萃取技術(shù)對樣品進(jìn)行純化，純化后樣品峰型與分離度都得到明顯改善，所獲得的寶坻大蒜指紋圖譜滿足要求.通過與對照品保留時間比對，確定了大蒜中2種重要含硫化合物二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚的保留時間，并以二烯丙基二硫醚為內(nèi)參比峰.采用夾角余弦法計算相似度并與《中藥色譜指紋圖譜相似度系統(tǒng)2004A》軟件計算結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明2種計算結(jié)果較為一致，樣品相似度良好.利用HPLC技術(shù)對比研究了不同批次寶坻“六瓣紅”大蒜樣品，確定了14個共有峰，建立了寶坻“六瓣紅”大蒜HPLC化學(xué)指紋圖譜.該方法為寶坻“六瓣紅”大蒜化學(xué)成分分析提供了理論依據(jù)，為科學(xué)、全面評價寶坻“六瓣紅”大蒜品質(zhì)及新品種培育提供了可靠的檢測方法.

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