膽道閉鎖膽管細(xì)胞破壞與修復(fù)的研究進(jìn)展

熊希倩，詹江華

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）以肝內(nèi)、外膽管梗阻，進(jìn)行性炎癥及肝纖維化為主要病理特征，早期行葛西（Kasai）手術(shù)雖可改善膽汁淤積，但不能終止肝纖維化進(jìn)程［1-2］。膽管上皮細(xì)胞受損后，可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，使膽管細(xì)胞破壞、增殖和膽管結(jié)構(gòu)重建［3］。研究表明，增生的膽管細(xì)胞以非成熟膽管上皮細(xì)胞為主，而這些不成熟膽管上皮細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)迅速增生，可能是BA膽管纖維化迅速惡化的主要原因［4］。本文就膽管細(xì)胞破壞及其修復(fù)過(guò)程進(jìn)行綜述。

1 膽管結(jié)構(gòu)改變

膽管分為肝內(nèi)膽管和肝外膽管，Kasai手術(shù)能夠解除肝外膽道梗阻癥狀，但無(wú)法改變肝內(nèi)膽管結(jié)構(gòu)，因此BA患兒在Kasai術(shù)后仍表現(xiàn)為進(jìn)行性肝內(nèi)小膽管破壞、膽汁淤積、肝硬化。BA肝內(nèi)膽管早期改變?yōu)閰R管區(qū)水腫、膽管增生、毛細(xì)膽管淤膽、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見(jiàn)匯管區(qū)周?chē)渭?xì)胞化生為膽管細(xì)胞，與增生膽管相互連接；晚期大量間質(zhì)成分增生，匯管區(qū)出現(xiàn)纖維化及橋接壞死，膽管管腔狹窄或閉鎖，膽管上皮細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)受到破壞。電鏡下超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞變性、空泡形成、細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)萎縮及基底膜增厚、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線(xiàn)粒體腫脹、毛細(xì)膽管上皮微絨毛缺失或形態(tài)異常，以上為BA肝內(nèi)膽管基本病變［5］。Obayashi等［6］利用門(mén)管區(qū)膽管數(shù)量/門(mén)管區(qū)測(cè)量面積（the number of the bile ducts in the portal canal/measured surface area of the portal canal，BDP）比值作為BA患者Kasai術(shù)后預(yù)后指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)預(yù)后差（死亡或肝移植）的BDP比值為1.19±0.42，而預(yù)后好（自體肝生存）的BDP比值為1.64±0.53（P=0.04），說(shuō)明膽管數(shù)量與BA預(yù)后密切相關(guān)。劉丹丹等［7］證實(shí)Kasai術(shù)后肝門(mén)區(qū)膽管直徑總和大于300 μm的BA患兒比膽管直徑總和小于100 μm者預(yù)后好。然而能通暢引流膽汁功能的肝內(nèi)膽管的直徑和數(shù)量，以及肝內(nèi)膽管的直徑、數(shù)量與BA預(yù)后的關(guān)系等方面研究報(bào)道較少。

2 膽管上皮細(xì)胞破壞

2.1 圍生期病毒感染 圍生期多種病毒感染均與BA相關(guān)，其中輪狀病毒感染與BA關(guān)系的研究較為深入，不僅在BA患兒肝臟檢測(cè)到了輪狀病毒，新生鼠感染輪狀病毒還能制作出小鼠的BA模型。德國(guó)學(xué)者Petersen［8］給新生鼠腹腔注射恒河猴輪狀病毒（rhesus monkeys rotavirus，RRV），可觀(guān)察到約75%的新生鼠發(fā)生與人類(lèi)BA完全一致的肝內(nèi)外膽管損傷，現(xiàn)已成為目前研究BA發(fā)病機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)模型［9-12］。RRV是一種二十面體、無(wú)包膜、雙鏈RNA病毒，具有三層蛋白質(zhì)衣殼（VP4、VP6和VP7）。Lobeck等［10］發(fā)現(xiàn)輪狀病毒誘導(dǎo)的BA小鼠會(huì)依賴(lài)VP6蛋白引起的細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶（ERK）磷酸化，并引發(fā)鈣內(nèi)流，促進(jìn)病毒在膽管細(xì)胞中復(fù)制，病毒產(chǎn)量不斷增加。

輪狀病毒受體包括整聯(lián)蛋白α2β1、α4β1、αVβ3和αXβ2，整聯(lián)蛋白是一類(lèi)分布廣泛的黏附受體，可以激活多種信號(hào)通路，從而在細(xì)胞黏附、增殖、分化、遷移、抗細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4（non structural protein 4，NSP4）是由第10位基因編碼的跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜糖蛋白，其對(duì)病毒的形態(tài)發(fā)生、復(fù)制及致病機(jī)制具有重要作用［13］。鄭帥玉等［14］通過(guò)激光共聚焦方法檢測(cè)到肝外膽管上皮細(xì)胞表面表達(dá)整聯(lián)蛋白α2β1，進(jìn)一步證實(shí)輪狀病毒NSP4和整聯(lián)蛋白α2亞基共區(qū)域存在于肝外膽管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，并且輪狀病毒NSP4從感染細(xì)胞向緊鄰的非感染細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)散，即整聯(lián)蛋白α2β1可以與輪狀病毒NSP4相互作用，并進(jìn)一步導(dǎo)致肝外膽管上皮細(xì)胞損傷。

除輪狀病毒外，巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、呼吸道腸道病毒等也與BA膽管上皮細(xì)胞的損傷有關(guān)，且有報(bào)道顯示在BA血液或組織中檢測(cè)到CMV感染的發(fā)生［15-16］，這為病毒感染引發(fā)BA提供了循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

2.2 免疫炎癥反應(yīng) 目前研究證實(shí)，γ-干擾素（IFN-γ）、CD8+T淋巴細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）均與輪狀病毒引起的新生鼠肝內(nèi)外膽管損傷有關(guān)，清除CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、Tregs或阻斷IFN-γ的表達(dá)后輪狀病毒均不能造成新生鼠膽管損傷，由此推斷輪狀病毒引起B(yǎng)A并不僅僅是對(duì)膽管上皮細(xì)胞的直接破壞所致，由輪狀病毒感染引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)可能才是BA形成的真正原因［17］。

病毒感染時(shí)，機(jī)體會(huì)調(diào)動(dòng)固有的免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗病毒的入侵，當(dāng)免疫炎癥反應(yīng)紊亂，就會(huì)造成膽管上皮細(xì)胞的損傷［17］。Okamura等［18］利用雙鏈 RNA（dsRNA）類(lèi)似物聚肌胞苷酸（poly I∶C）感染人BA膽管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)膽管上皮細(xì)胞有Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）的高表達(dá)。Shimada等［19］認(rèn)為T(mén)LR3-NK-κB/IRF3-CCL5通路（圖1）可能是BA膽管上皮細(xì)胞固有免疫反應(yīng)中的重要通路，病毒入侵機(jī)體后合成大量的dsRNA中間體，膽管上皮細(xì)胞中識(shí)別dsRNA，激活核因子（NF）-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），從而誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子CCL5，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞的破壞。

Fig.1 Proposed role of CCL5 in the pathogenesis of dsRNA virusmediated BA圖1 CCL5在dsRNA病毒介導(dǎo)的BA發(fā)病機(jī)制中的作用

膽管上皮細(xì)胞受損后，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，延長(zhǎng)激酶的激活時(shí)間，導(dǎo)致細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-6和IL-8的不平衡表達(dá)［20］。IL-6在肝損傷時(shí)從膽管上皮細(xì)胞釋放出來(lái)，直接促進(jìn)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞存活和再生［21］。血清IL-6的濃度與BA的嚴(yán)重程度有關(guān)［22］。伴有嚴(yán)重黃疸和門(mén)靜脈高壓的BA患兒血清中IL-8濃度顯著升高［23］。MAPK通路激活后，多種免疫細(xì)胞也被激活，活化的免疫細(xì)胞能直接殺傷或分泌多種細(xì)胞因子，損傷被感染的膽管上皮細(xì)胞［20］。Brindley等［24］發(fā)現(xiàn)BA患兒中Tregs的表達(dá)量低于正常對(duì)照，而Tregs的缺乏會(huì)使炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)增強(qiáng)，最終導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞破壞和膽管損傷。Shivakumar等［25］發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞能通過(guò)分泌穿孔素和顆粒酶使兩者產(chǎn)生協(xié)同作用，導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞損傷；可見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞的炎癥和免疫損傷是造成膽管纖維化改變的主要原因。

3 膽管修復(fù)

膽管修復(fù)過(guò)程包括膽管上皮細(xì)胞增生和膽管結(jié)構(gòu)重建，其病理學(xué)特征是出現(xiàn)活性膽管細(xì)胞?；钚阅懝芗?xì)胞與正常的膽管細(xì)胞相比具有特殊的生物學(xué)特性，前者具有一定程度的“可塑性”，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞分泌和屏障功能缺乏，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的表達(dá)［26-27］?；钚阅懝芗?xì)胞能夠產(chǎn)生大量的可溶性介質(zhì)，導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、固有淋巴細(xì)胞）和間充質(zhì)細(xì)胞（肝星狀細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞）的聚集，形成肝臟修復(fù)復(fù)合物［3］。

BA患兒早期膽管上皮增生時(shí)要比靜止時(shí)分泌更多的細(xì)胞因子，包括細(xì)胞黏附因子（CAM）、血小板衍生因子（PDGF）、炎癥因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、IFN-γ等。而這些細(xì)胞因子又趨化更多的基質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，引發(fā)瀑布或鏈鎖式炎癥反應(yīng)，加速了膽管受損、閉塞，直至纖維化的發(fā)生。Jun等［28］發(fā)現(xiàn)IL-33參與人類(lèi)膽管上皮細(xì)胞的增生過(guò)程，IL-33/2型固有淋巴細(xì)胞（ILC2）/IL-13通路的激活促進(jìn)BA小鼠模型的膽管修復(fù)。膽管細(xì)胞增生是膽管上皮細(xì)胞受損后的病理生理反應(yīng)，但這些增生膽管是否有引流膽汁的功能值得關(guān)注。Song等［29］發(fā)現(xiàn)癌癥亮氨酸拉鏈下調(diào)因子1（leucine zipper downregulated in cancer 1，LDOCl）基因表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)NF-κB入核，轉(zhuǎn)錄并激活下游炎癥因子IL-2和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)，導(dǎo)致膽道上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥損傷，進(jìn)而抑制膽管上皮細(xì)胞凋亡，小膽管阻塞，最終導(dǎo)致膽汁淤積這一BA特有的臨床病理表現(xiàn)。Zhang等［4］用CD56來(lái)標(biāo)記未成熟的膽管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)新形成未成熟的膽管或小膽管沒(méi)有膽汁運(yùn)輸功能，膽汁無(wú)法正常引流，最終形成膽栓。

4 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肝纖維化的關(guān)系

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelium mesenchymal transi?tion，EMT）指在外界因素作用下，上皮細(xì)胞失去極性，變成間葉細(xì)胞獨(dú)特的紡錘型的現(xiàn)象。在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，發(fā)現(xiàn)間葉細(xì)胞標(biāo)志物（如α平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白等）表達(dá)均上調(diào)［30］，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如CK-19等）表達(dá)下調(diào)［31］，肝細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)促進(jìn)EMT的轉(zhuǎn)錄因子snail［32］。Xue等［33］提出可以通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的變化而逆轉(zhuǎn)或者減弱EMT過(guò)程。眾所周知，TGF-β1是肝纖維化過(guò)程中的敏感因子，可促進(jìn)組織纖維化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和膠原沉積［34］。目前認(rèn)為各種因素導(dǎo)致的膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT是導(dǎo)致肝纖維化的主要病理進(jìn)程之一［35］。

5 總結(jié)和展望

病毒入侵機(jī)體引起B(yǎng)A，不僅與病毒不斷復(fù)制引起膽管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)，更主要是其引起膽管上皮細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)增高，從而引發(fā)一系列免疫炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致膽管的持續(xù)性損傷和肝纖維化的發(fā)生。膽管修復(fù)包括膽管細(xì)胞增生和膽管結(jié)構(gòu)重塑，但BA增生的膽管以未成熟膽管為主，基本沒(méi)有膽汁引流功能。而更多細(xì)胞因子的分泌，趨化更多的基質(zhì)細(xì)胞及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，引發(fā)鏈鎖式炎癥反應(yīng)，加速了膽管受損、閉塞，直至纖維化的發(fā)生。EMT在BA的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，抑制EMT相關(guān)分子的表達(dá)或許有助于阻止BA膽管纖維化進(jìn)程。隨著B(niǎo)A膽管上皮細(xì)胞破壞和膽管修復(fù)機(jī)制研究的深入，如何促進(jìn)增生膽管的成熟及阻止BA進(jìn)程中各種因子介導(dǎo)的鎖鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)，將成為今后工作中需要解決的問(wèn)題。

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