缺氧誘導(dǎo)因子與糖尿病腎病

杜小紅 綜述 謝紅浪 審校

缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是機(jī)體適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其對(duì)糖類等物質(zhì)的調(diào)節(jié)在一定程度上可改善機(jī)體能量代謝，保證低氧下的細(xì)胞代謝平衡。大量研究表明[1-2]，除低氧之外，高糖可能是調(diào)控HIF表達(dá)的另一重要因子，糖尿病腎病(DN)時(shí)HIF表達(dá)明顯增加，能進(jìn)一步加重腎臟纖維化、促進(jìn)終末期腎病發(fā)生。而二甲雙胍抑制HIF表達(dá)作用，將成為其治療DN的重要機(jī)制之一。本文擬就低氧下的糖代謝變化，高糖及二甲雙胍對(duì)HIF的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制進(jìn)行綜述，為DN的治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

HIF-1的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特點(diǎn)

HIF是一種異源蛋白二聚體，由HIF-α和HIF-β兩個(gè)亞基組成。其中，α亞基的活性受缺氧信號(hào)的調(diào)控，β亞基在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；只有α活性亞基與β亞基相互連接形成異二聚體時(shí)，HIF才可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與缺氧反應(yīng)元件(HRE)的DNA序列相結(jié)合，調(diào)節(jié)多個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。在正常氧供時(shí)，依賴機(jī)體內(nèi)氧及鐵的HIF脯氨酰羥化(PHD)酶可誘導(dǎo)HIF-α亞基上氧依賴區(qū)域(ODD)內(nèi)的脯氨酸殘基羥基化，羥基化的HIF繼而被希佩爾-林道(von Hippel-Lindau，VHL)泛素連接酶辨識(shí)并泛素化，最后被蛋白酶體快速降解。因此，正常情況下細(xì)胞內(nèi)基本檢測不出α亞基的存在；在低氧狀態(tài)下，HIF-α亞基才可以避免泛素蛋白酶體系統(tǒng)的降解作用，維持HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。而具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白HIF-1能調(diào)節(jié)參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要因子轉(zhuǎn)錄，適應(yīng)低氧環(huán)境[3]。

HIF對(duì)糖代謝的影響

長期低氧適應(yīng)能影響糖代謝，如糖攝取、利用、氧化等作用增強(qiáng)，雖其具體作用機(jī)制尚不明確，但目前認(rèn)為HIF主要通過上調(diào)糖代謝相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)糖代謝過程。

增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(GLUT)表達(dá)缺氧情況下細(xì)胞主要依賴葡萄糖無氧糖酵解供能，其中葡萄糖通過載體跨膜轉(zhuǎn)入胞內(nèi)是細(xì)胞糖代謝的限速步驟；而GLUT1作為葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，其在細(xì)胞膜上表達(dá)量可能是機(jī)體適應(yīng)缺氧、缺血等應(yīng)激狀態(tài)的一個(gè)重要調(diào)控機(jī)制。早期即發(fā)現(xiàn)GLUT1基因片段中含HIF結(jié)合位點(diǎn)(HBS)，缺氧可誘導(dǎo)GLUT1 mRNA表達(dá)，上調(diào)GLUT1水平。Ouiddir等[4]證實(shí)低氧能誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的GLUT1活性增加；且GLUT1 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)呈缺氧濃度、時(shí)間依賴性，即基因表達(dá)隨氧濃度降低和缺氧時(shí)間延長而顯著增加。而Fujino等[5]同樣證明HIF促進(jìn)GLUT1的表達(dá)。

除了直接誘導(dǎo)GLUT表達(dá)，HIF介導(dǎo)的胰島素及胰島素受體表達(dá)和敏感性增強(qiáng)，間接促進(jìn)GLUT轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)運(yùn)的能力增強(qiáng)。由于胰島素與其受體的結(jié)合，可以促進(jìn)囊泡內(nèi)GLUT發(fā)生細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位效應(yīng)，提高膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體密度。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與久居高海拔人群的血清胰島素水平顯著升高不同，暴露于高海波(約5 000米)的大鼠體內(nèi)胰島素水平雖降低，胰高血糖素顯著升高，但胰島素敏感性的增加仍然導(dǎo)致血糖水平的顯著下降。因此胰島素、胰島素受體數(shù)量以及胰島素敏感性均影響GLUT轉(zhuǎn)位，從而影響葡萄糖代謝。GLUT的表達(dá)、儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)位增加是低氧下HIF調(diào)節(jié)葡萄糖攝取的基礎(chǔ)。

增加糖酵解實(shí)驗(yàn)證實(shí)，為彌補(bǔ)低氧時(shí)的產(chǎn)能不足，機(jī)體內(nèi)聚集的HIF通過低氧誘導(dǎo)反應(yīng)下調(diào)有氧磷酸化過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)[7]，如已糖激酶(HK)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK 1)等，增加糖酵解活性。但脯氨酰羥化酶3(PHD3)介導(dǎo)的丙酮酸激酶M2(PKM2)羥基化可促進(jìn)糖酵解和HIF間的相互作用，認(rèn)為這是HIF在缺氧條件下發(fā)揮功能的首要條件；Luo等[8]發(fā)現(xiàn)定位在細(xì)胞核上的PKM2可與HIF直接結(jié)合并相互提高轉(zhuǎn)錄水平，形成正反饋調(diào)節(jié)。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)主要依賴糖酵解進(jìn)行代謝，產(chǎn)生乳酸；稱之為Warburg效應(yīng)。而PKM2在增殖細(xì)胞中高度表達(dá)，尤其是腫瘤細(xì)胞，這對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝極其重要。除此之外，腫瘤患者體內(nèi)突變或過度表達(dá)的癌基因Myc與HIF的相互作用能提高糖酵解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)葡萄糖攝取[9]。由此可知，低氧時(shí)活化的HIF能夠增加糖酵解活性。

DN時(shí)HIF的變化

在小鼠DN模型的腎組織中，實(shí)驗(yàn)者利用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行細(xì)胞核染色，并通過免疫組化法檢測HIF表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DN腎組織中HIF水平較正常組明顯上升[1-2]。并在鏈脲霉素誘導(dǎo)的1型糖尿病和db/db型的2型糖尿病小鼠模型中[1]，及高糖處理的海馬神經(jīng)元內(nèi)[10]，均表現(xiàn)出HIF的上調(diào)。故高糖是除低氧外，影響DN時(shí)HIF表達(dá)的另一重要因素。關(guān)于DN時(shí)HIF的改變，主要通過以下兩種信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控。

ChRE/HIF mRNA通路Isoe等[1]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠模型中腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)HIF表達(dá)增加；且DN時(shí)HIF的表達(dá)呈血糖依耐性上升；而同等滲透壓下的非糖物質(zhì)組內(nèi)HIF表達(dá)并無明顯改變，故認(rèn)為HIF變化與高血糖有關(guān)，且主要與HIF-1αmRNA的轉(zhuǎn)錄增加相關(guān)。由于人類及小鼠的HIF-1α基因序列含有碳水化合物反應(yīng)元件(ChRE)，即葡萄糖作用位點(diǎn)[11]；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ChRE能介導(dǎo)高糖條件下HIF-1αmRNA的表達(dá)上調(diào)[1]。這可能是因?yàn)樘妓衔锓磻?yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)作為一類與ChRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞及組織內(nèi)葡萄糖代謝；而高糖通過刺激胞內(nèi)ChREBP轉(zhuǎn)入核內(nèi)，參與系膜細(xì)胞內(nèi)HIF及其目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控[12]。目前認(rèn)為高糖通過促進(jìn)HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)HIF水平，這與低氧防止HIF降解，保證HIF含量穩(wěn)定的作用機(jī)制不同。

AGE/Morg1/PHD3/HIF通路晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)與其受體(RAGE)結(jié)合抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)組織蛋白1(Morg1)表達(dá)是DN患者體內(nèi)HIF水平上調(diào)的另一機(jī)制。DN時(shí)，AGEs可進(jìn)一步促進(jìn)足細(xì)胞內(nèi)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)表達(dá)，AngⅡ作為G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑，通過激活MAPK信號(hào)通路，影響MAPK酶聯(lián)反應(yīng)中支架蛋白Morg1的表達(dá)。而Morg1作為PHD3激活劑，能抑制HIF表達(dá)。Bondeva等[2]證實(shí)與對(duì)照組相比，AGE-BSA作用下的Morg1 mRNA表達(dá)顯著抑制，且主要集中于RAGE高表達(dá)的小鼠近端腎小管細(xì)胞(MTC)及足細(xì)胞內(nèi)，表明AGE顯著抑制Morg1表達(dá)；同時(shí)HZ(Morg1+/-)小鼠體內(nèi)的HIF表達(dá)顯著高于WT(Morg1+/+)小鼠。因此，DN時(shí)，高表達(dá)的AngⅡ與AGE/RAGE，通過激活Morg1/PHD3/HIF信號(hào)通路，上調(diào)體內(nèi)HIF表達(dá)。

此外，腎小球高壓、旁分泌或內(nèi)分泌因素以及氧化應(yīng)激等也影響DN時(shí)HIF的水平。

而基因多態(tài)性作為HIF-1α的重要生物特性，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如腫瘤、糖尿病、心血管疾病等。但近期研究證實(shí)，HIF-1α的Pro582Ser多態(tài)性(rs11549465)與DN密切相關(guān)[13-14]。這主要是由于HIF-1α基因外顯子存在rs11549465多態(tài)性，其中C→T突變誘導(dǎo)脯氨酸變?yōu)榻z氨酸(Pro582Ser)；在缺氧、高糖兩者因素的共同作用下，CT及TT基因型的轉(zhuǎn)錄水平將顯著高于CC基因型，最終影響HIF-1α的表達(dá)及其對(duì)下游信號(hào)基因的調(diào)控。此外，Bi等[14]指出HIF-1α的基因多態(tài)性對(duì)DN不同階段影響存在差異性。DN早期，上調(diào)的HIF-1α通過促進(jìn)血紅素加氧酶1、糖酵解酶等靶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)低氧狀態(tài)，發(fā)揮腎保護(hù)作用；當(dāng)DN發(fā)展到一定階段，過度表達(dá)的HIF-1α反而加重腎纖維化程度。這可能與以下機(jī)制相關(guān)[15]：首先，活化的HIF能刺激炎癥細(xì)胞的增殖，并集聚于腎損部位，這對(duì)腎臟成纖維瘢痕的形成至關(guān)重要；其次，HIF可與促纖維化的下游信號(hào)基因相結(jié)合，如膠原蛋白1、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)等，導(dǎo)致間質(zhì)膠原的生成，減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。除ECM的沉積作用外，HIF還參與腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，它通過促進(jìn)間質(zhì)信號(hào)表達(dá)，抑制上皮信號(hào)傳導(dǎo)，繼而誘導(dǎo)ECM的合成[16]。而逐漸積聚的ECM最終將破壞正常腎組織，促進(jìn)腎纖維化。

二甲雙胍對(duì)HIF的影響

Nayak等[17]發(fā)現(xiàn)抑制HIF活性可減輕DN的蛋白尿及腎纖維化程度，故干預(yù)HIF可能成為延緩DN進(jìn)展的重要機(jī)制。最新研究指出，二甲雙胍能減輕DN中蛋白尿的腎毒性損害，產(chǎn)生腎保護(hù)作用[18-19]。作為2型糖尿病的一線治療藥物，其主要作用是抑制肝糖原的產(chǎn)生[20]。但近年來，二甲雙胍在癌癥治療領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注[21-22]。在糖尿病的降糖治療中，研究者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能顯著降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，改善患者生存率[21]，這可能與HIF機(jī)制相關(guān)。由于缺氧作為腫瘤生存微環(huán)境的主要特征，能顯著影響其臨床治療效果[23]。Li等[24]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二甲雙胍有效抑制低氧環(huán)境下HIF表達(dá)。除直接解除高糖導(dǎo)致HIF 表達(dá)增加，二甲雙胍還通過以下機(jī)制間接調(diào)控低氧下HIF水平。

降低氧耗減少HIF表達(dá)二甲雙胍是線粒體呼吸鏈中復(fù)合物Ⅰ的抑制劑，在小劑量時(shí)即可抑制其活性。為模擬二甲雙胍對(duì)HIF的調(diào)控，Takiyama等[25]分別利用線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑(CHC)、mTOR抑制劑(雷帕霉素)、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體1、3抑制劑(魚藤酮、抗霉素A)分別對(duì)小鼠細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)CHC及雷帕霉素并未影響HIF的水平，而呼吸鏈酶抑制劑能顯著抑制HIF表達(dá)。且Zhao等[26]對(duì)小鼠進(jìn)行低氧敏感染料(哌莫硝唑)，染色處理，結(jié)果顯示口服二甲雙胍實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)低氧染色較對(duì)照組明顯減弱，進(jìn)一步證實(shí)二甲雙胍通過抑制線粒體氧耗，減少ATP生成，提高細(xì)胞氧合作用，抑制HIF表達(dá)。

抑制HIF聚集及轉(zhuǎn)錄表達(dá)二甲雙胍能抑制低氧下HIF聚集。Zhou等[27]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)HIF的抑制作用呈劑量-時(shí)間依賴性。與低氧下HIF表達(dá)增加相比，二甲雙胍能降低肝細(xì)胞內(nèi)HIF水平，且保持持續(xù)抑制狀態(tài)；而當(dāng)二甲雙胍濃度超過10 mmol/L時(shí)，HIF表達(dá)將完全被抑制。除此之外，二甲雙胍抑制HIF相關(guān)轉(zhuǎn)錄蛋白的表達(dá)，如GLUT1、VEGF等。與既往結(jié)論不同，該實(shí)驗(yàn)顯示二甲雙胍處理組中HIF-mRNA的水平并無改變。故證實(shí)二甲雙胍誘導(dǎo)的HIF減少受翻譯后機(jī)制調(diào)控。

早期有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK-mTOR-HIF信號(hào)通路是二甲雙胍抑制腫瘤生長的主要機(jī)制[28-29]。Takiyama等[25]證實(shí)缺氧下的AMPK激活劑(AICAR)雖能增加AMPK磷酸化，減少磷酸化的mTOR，但并不抑制HIF表達(dá)。Zhou等[27]利用小干擾RNA(siRNA)及AMPK抑制劑(復(fù)合物 C)誘導(dǎo)AMPK的失活，結(jié)果顯示與單用二甲雙胍治療組相比，實(shí)驗(yàn)組HIF水平并未顯著增加，即失活的AMPK并沒有解除二甲雙胍對(duì)HIF的抑制作用。表明二甲雙胍對(duì)HIF的調(diào)控并非依賴AMPK的調(diào)控。由于HIF水平受合成及降解兩方面的調(diào)節(jié)，故研究者利用蛋白酶抑制劑MG-132進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)MG-132能夠解除二甲雙胍對(duì)HIF的抑制作用，HIF水平較前升高，再次證實(shí)二甲雙胍通過誘導(dǎo)蛋白酶體對(duì)HIF-1α的降解來抑制HIF聚集(圖1)[25]。

圖1 二甲雙胍調(diào)節(jié)HIF-1水平[26]二甲雙胍通過抑制線粒體呼吸抑制低氧誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白質(zhì)表達(dá)。二甲雙胍通過抑制線粒體氧耗導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧氣再分配，促進(jìn)HIF-1α蛋白降解；ATP消耗減少能激活A(yù)MPK，誘導(dǎo)AMPK-mTOR信號(hào)通路的激活，促進(jìn)相關(guān)蛋白的合成。因此，AICAR本身并不抑制低氧誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)；HIF：缺氧誘導(dǎo)因子；AMPK:腺苷酸活化蛋白激酶;ATP:三磷酸腺苷;AICAR：AMPK依賴性蛋白激酶激動(dòng)劑；TSC：結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；ACC：抗乙酰輔酶A羥化酶；PAI-1：纖溶酶原激活物抑制劑1；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；Glut-1：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1

盡管二甲雙胍對(duì)HIF的抑制導(dǎo)致低氧下GLUT1表達(dá)減少，影響體內(nèi)糖代謝水平；但二甲雙胍誘導(dǎo)的AMPK活化可以提高GLUT1/4及糖酵解相關(guān)酶的水平，促進(jìn)細(xì)胞或組織對(duì)葡萄糖的利用[30]，同時(shí)解除高血糖本身通過解偶聯(lián)途徑增加氧耗，改善機(jī)體缺氧狀態(tài)。除AMPK作用外，二甲雙胍對(duì)線粒體呼吸抑制能導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化的減弱，誘導(dǎo)巴斯德反應(yīng)，產(chǎn)生低氧適應(yīng)。腎缺氧作為DN的早期表現(xiàn)，亦是所有腎臟疾病的共同代謝途徑。因此，在慢性腎臟病，尤其是DN中，二甲雙胍顯著改善腎近端小管上皮細(xì)胞內(nèi)缺氧及氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制HIF表達(dá)，產(chǎn)生腎保護(hù)作用。

小結(jié)：HIF是一類具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝過程。高糖水平是影響HIF及其目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的另一重要因素。缺氧和腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病的共同病理特點(diǎn)，受活化HIF的調(diào)控。與其他腎臟疾病相比，DN時(shí)HIF增加更明顯，敲除HIF可能成為DN新的治療手段。二甲雙胍作為一線降糖藥，除能解除高糖對(duì)HIF的誘導(dǎo)作用，亦通過減少氧耗、促進(jìn)蛋白酶解，降低DN患者體內(nèi)的HIF水平，從而有可能延緩或阻止腎纖維化，改善腎臟損害進(jìn)展。同時(shí)HIF在血管生物學(xué)方面的核心作用，也為DN患者心血管并發(fā)癥的預(yù)防及診治提供新靶點(diǎn)。

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