基于硝基還原酶/甲硝唑系統(tǒng)構(gòu)建斑馬魚急性腎損傷模型

侯 慶 汪 玲 張利文 朱小東 秦衛(wèi)松 曾彩虹 劉志紅 陳朝紅

斑馬魚前腎結(jié)構(gòu)簡單，胚胎透明，發(fā)育迅速，與哺乳動物腎臟高度同源和保守，是研究腎臟疾病的理想模型[1]，包括急性腎損傷(AKI )[2]。AKI是臨床上常見的一種綜合征，表現(xiàn)為腎功能下降或喪失，腎小管上皮細(xì)胞脫落等。慶大霉素可誘導(dǎo)斑馬魚幼魚和成魚AKI[3]，腎小管標(biāo)志物slc20a1a表達(dá)會隨之消失或減弱，損傷或丟失，腎小管重吸收功能下降或喪失；利用激光同樣可選擇性損傷斑馬魚腎小管，熒光染料或轉(zhuǎn)基因魚標(biāo)記斑馬魚腎小管損傷程度。上述方法均需要通過心臟注射慶大霉素或者熒光染料，達(dá)到斑馬魚腎小管損傷或標(biāo)記定位并使用激光消融損傷的目的，這兩種方法操作繁瑣、損傷時(shí)間和劑量不均一，且損傷數(shù)量有限，耗時(shí)耗力，不是理想的斑馬魚AKI模型，所以建立一個(gè)新的斑馬魚AKI模型很有必要。

本研究基于硝基還原酶/甲硝唑(NTR/MTZ)損傷原理[4]，分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)，在雙轉(zhuǎn)基因Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)胚胎中使用MTZ 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷以模擬AKI。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)對象野生型斑馬魚(AB品系)，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)，飼養(yǎng)系統(tǒng)(PENTAIR)，飼養(yǎng)溫度28.5℃，14h/10h交替照明。斑馬魚胚胎在28.5℃培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合南京總醫(yī)院動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

主要試劑BSA、DIG RNA Labeling Mix、AP-anti-DIG antibody、NBT/NCIP ready-to-use tablets(Roche)，MAXIscript T7 Kit、mMESSAGE mMACHINE T3 Kit、MEGAclear Kit(Ambion)，DNA clean and concentrator、RNA clean and concentrator、plasmid miniprep kit、RNA miniprep Kit(ZYMO Research),Trizol(Invitrogen)，10KD FITC-Dextran(Molecular Probe)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher)，tricaine、MTZ、多聚甲醛、Tween-20、蛋白酶K、20×SSC、、tRNA、(SIGMA)，(Jackson Immuno Research)，去離子甲酰胺(Amresco)，pEASY-T5 Zero cloning kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×SuperMix Taq PCR酶(Transgene)，Phusion高保證PCR酶、限制性內(nèi)切酶(NEB)。

轉(zhuǎn)基因斑馬魚質(zhì)粒enpep啟動子序列[5]通過PCR從斑馬魚基因組中擴(kuò)增所得，克隆入pTol2-podocin:Gal4質(zhì)粒中將podocin啟動子替換(雙酶切位點(diǎn)為XhoI和BamHI)，構(gòu)建成pTol2-enpep:Gal4載體，并經(jīng)測序驗(yàn)證序列。UAS:NTR-mCherry轉(zhuǎn)基因魚表達(dá)質(zhì)粒由美國密西根大學(xué)Weibin Zhou惠贈[6]。

RNA體外合成和顯微注射Capped Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA體外轉(zhuǎn)錄模板是用限制性內(nèi)切酶XbaI將pT3TS-tol2(Pdb600)線性化，純化回收線性化質(zhì)粒，作為模板，用mMESSAGE mMACHINE T3 kit體外轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)座酶mRNA，用MEGAclear Kit回收體外轉(zhuǎn)錄的mRNA。將轉(zhuǎn)座酶mRNA(25 ng/μl)和轉(zhuǎn)基因魚表達(dá)質(zhì)粒(20 ng/μl)共同顯微注射入野生型AB斑馬魚胚胎單細(xì)胞，置于胚胎培養(yǎng)水中，28.5℃培養(yǎng)箱飼養(yǎng)。通過基因分析PCR，逐代篩選F0和F1。

原位雜交探針合成斑馬魚slc20a1amRNA反義鏈探針模板通過PCR從斑馬魚cDNA模板擴(kuò)增獲取，克隆入pEASY-T5 Zero cloning載體，提取質(zhì)粒后送測序鑒定。利用M13上下游引物擴(kuò)增出slc20a1探針模板，純化回收PCR產(chǎn)物，以PCR產(chǎn)物作為模板， MAXIscript T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶體外轉(zhuǎn)錄slc20a1反義鏈RNA探針，60℃水解RNA探針至100nt，純化回收水解后的反義鏈RNA探針。

全胚胎原位雜交斑馬魚胚胎固定于4%多聚甲醛4℃過夜，次日用無水甲醇清洗，置于-20℃脫水過夜后用于后續(xù)原位雜交。第一天：60%甲醇/PBS，30%甲醇/PBS依次水化標(biāo)本，PBST(含0.1% Tween-20)清洗2次，PBST/蛋白酶K室溫消化組織，4%多聚甲醛再固定標(biāo)本，65℃預(yù)雜交(不含探針)，65℃雜交過夜(含探針)；第二天：65℃下，50%去離子甲酰胺/2×SSC清洗2次×30 min，2×SSCT清洗1次×15 min，0.2×SSCT清洗2次×30 min，PBST室溫清洗1次×5 min，PBST-SB(5% sheep serum+2 mg/ml BSA)孵育2h以上，地高辛抗體4℃孵育過夜(用PBST-SB稀釋4 000倍)；第三天：PBST室溫清洗5次×5 min，加入NBT/BCIP顯色液避光顯色。顯色結(jié)束后，PBS清洗顯色液，多聚甲醛再固定，封片，拍照。

腎小管重吸收功能用0.02% tricaine (sigma A5040) 麻醉MTZ處理48h后的胚胎，將麻醉后的胚胎置于1.5%瓊脂糖顯微注射模具中，20 ng/μl的 10KD FITC-Dextran經(jīng)心臟注射，4h后在熒光顯微鏡下觀察腎小管重吸收功能。

電鏡斑馬魚胚胎于3.75%戊二醛固定，乙醇、丙酮脫水，丙酮、樹脂置換和浸透，包埋和切片，透射電子顯微鏡下觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

轉(zhuǎn)基因魚構(gòu)建Huang等[7]利用MTZ/NTR系統(tǒng)構(gòu)建了足細(xì)胞特異性損傷模型。在足細(xì)胞中特異性高表達(dá)硝基還原酶 ，利用MTZ對轉(zhuǎn)基因魚處理，本無毒性的MTZ被NTR還原為細(xì)胞毒性的代謝物，特異性致死表達(dá)NTR的足細(xì)胞，而對其他未表達(dá)NTR的細(xì)胞并無任何損傷?；谏鲜鲈?，我們分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因魚Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)，將上述兩種轉(zhuǎn)基因魚雜交后可獲得雙轉(zhuǎn)基因魚Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)，光顯微鏡下可觀察到在斑馬魚腎小管特異性表達(dá)紅色熒光mCherry(圖1)

圖1 轉(zhuǎn)基因魚Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)在前腎小管中表達(dá)NTR-mCherryA：Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)轉(zhuǎn)基因魚載體模式圖；NTR/MTZ損傷原理模式圖，NTR和熒光蛋白(FP)融合蛋白在組織特異性啟動子的驅(qū)動下表達(dá)，當(dāng)加入MTZ時(shí)，NTR+細(xì)胞被，而毗鄰NTR-細(xì)胞不受任何影響；B：酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因Gal4在腎小管enpep啟動子的驅(qū)動下，NTR-mCherry融合基因在上游激活序列UAS啟動子的驅(qū)動下，Gal4可以識別并激活UAS啟動子序列，NTR-mCherry表達(dá)部位取決于enpep啟動子。48hpf Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)，紅色熒光表示腎小管(含近端小管，遠(yuǎn)端小管和集合管)；NTR：硝基還原酶/甲硝唑

圖2 甲哨唑(MTZ)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷A：MTZ誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因幼魚Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)腎小管上皮細(xì)胞損傷后出現(xiàn)心包水腫(↑)和身體水腫(↑)；B：MTZ誘導(dǎo)Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)腎小管上皮細(xì)胞損傷，呈劑量依賴性。*：P<0.05

MTZ劑量依賴性的腎小管損傷斑馬魚前腎腎小管在28hpf(hours post fertilization,hpf)時(shí)發(fā)育成熟，具有重吸收功能。我們選擇在48 hpf對Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)胚胎加入MTZ，處理的劑量濃度依次為DMSO對照組、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L，處理24h后撤除MTZ并實(shí)時(shí)觀察，結(jié)果顯示，在處理24h僅有高濃度500 μmol/L組出現(xiàn)輕微的心包水腫，48h 300 μmol/L和400 μmol/L組均出現(xiàn)明顯心包水腫，500 μmol/L組心包水腫率明顯增加且出現(xiàn)身體水腫(圖2A)。隨著MTZ的處理劑量的增加，胚胎的水腫率顯著增加(依次為0、10%、15%、40%、85%)(圖2B)。96h后，400 μmol/L和500 μmol/L組胚胎均死亡。為了觀察后續(xù)藥物處理對AKI損傷后修復(fù)的結(jié)果，我們選擇500 μmol/L MTZ處理48h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量和時(shí)間。

MTZ誘導(dǎo)腎小管損傷對slc20a1a表達(dá)的影響slc20a1a是斑馬魚近端小管的標(biāo)志物，近端小管損傷會導(dǎo)致slc20a1a表達(dá)消失或下降[8]。MTZ誘導(dǎo)損傷24h，全胚胎原位雜交結(jié)果顯示slc20a1a表達(dá)消失，表明近端腎小管損傷嚴(yán)重(圖3)。電鏡結(jié)果顯示，MTZ誘導(dǎo)腎小管損傷后，近端小管上皮細(xì)胞丟失且損傷，正常細(xì)胞形態(tài)喪失，管腔擴(kuò)大且管腔中可見急性脫落的刷狀緣和微管結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖3 斑馬魚全胚胎slc20a1a原位雜交A(側(cè)面)和C(背面)為正常對照組slc20a1a mRNA表達(dá)情況，B(側(cè)面)和D(背面)為甲硝唑(MTZ)處理組slc20a1a mRNA表達(dá)情況，白色虛線框內(nèi)為slc20a1a原位雜交信號

圖4 甲硝唑(MTZ)誘導(dǎo)腎小管損傷(EM)A、B：正常對照組腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)完整，管腔完好，刷狀緣密集(圖B為局部放大圖)；C、D：MTZ處理組腎小管上皮脫落，管腔擴(kuò)大，刷狀緣脫落至管腔中

MTZ誘導(dǎo)腎小管損傷導(dǎo)致腎小管重吸收功能喪失腎小管損傷會導(dǎo)致重吸收功能喪失或下降，為了檢測MTZ誘導(dǎo)腎小管損傷是否能夠?qū)е履I小管重吸收功能喪失或下降，在MTZ誘導(dǎo)損傷后48h經(jīng)過心臟顯微注射低分子量的10 kD FITC-Dextran，4h后在熒光顯微鏡下觀測近端小管綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，未損傷組中胚胎近端小管綠色熒光高度聚集，而損傷組中未見明顯綠色熒光，結(jié)果表明MTZ誘導(dǎo)腎小管損傷會導(dǎo)致腎小管重吸收功能喪失(圖5)。

圖5 近端小管重吸收功能評估A(5倍)和B(10倍)為正常對照組，C(5倍)和D(10倍)為甲哨唑(MTZ)處理組。正常對照組近端小管可見明顯綠色熒光染料聚集(白色虛線框內(nèi))，表明近端小管重吸收功能完好；而MTZ處理組未見明顯綠色熒光染料聚焦，表明近端小管重吸收功能喪失

討 論

AKI是常見的臨床綜合征，腎小管上皮細(xì)胞損傷和脫落，腎功能急劇下降，腎小管擴(kuò)張且重吸收功能喪失[9]。本研究基于NTR/MTZ原理[4]，構(gòu)建了斑馬魚腎小管上皮細(xì)胞損傷模型以模擬AKI，結(jié)果顯示MTZ可成功誘導(dǎo)斑馬魚近端小管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物slc20a1a表達(dá)降低；電鏡結(jié)果顯示近端小管上皮細(xì)胞損傷和脫落，管腔擴(kuò)張，刷狀緣脫落值管腔中；經(jīng)心臟注射低分子量10 kD FITC-Dextran，發(fā)現(xiàn)近端小管重吸收功能喪失。其表型與人及動物實(shí)驗(yàn)表型相似，表明此斑馬魚AKI模型構(gòu)建成功。

Hentschel等[10]建立的慶大霉素誘導(dǎo)斑馬魚AKI模型和Johnson等[3]建立的激光消融法斑馬魚AKI模型各有優(yōu)勢，然而操作相對繁瑣，耗時(shí)耗力。慶大霉素誘導(dǎo)斑馬魚AKI模型需要通過72 hpf的斑馬魚胚胎心臟顯微注射慶大霉素，既不能保證每個(gè)胚胎注射劑量的一致性，又不能避免慶大霉素的副作用；激光消融雖然可以選擇性損傷部分近端小管保留大部分完好的腎單位，卻也需要通過心臟注射熒光染料對近端小管進(jìn)行標(biāo)記，并且還需要單獨(dú)對每個(gè)胚胎進(jìn)行激光消融。

Huang等[7]利用MTZ/NTR系統(tǒng)構(gòu)建了足細(xì)胞特異性損傷模型。在足細(xì)胞中特異性高表達(dá)NTR，利用MTZ對轉(zhuǎn)基因魚處理，本無毒性的MTZ被NTR還原為細(xì)胞毒性的代謝物，特異性致死表達(dá)NTR的足細(xì)胞，而對其他未表達(dá)NTR的細(xì)胞并無任何損傷?；谏鲜鲈恚覀儤?gòu)建了腎小管上皮細(xì)胞特異性損傷模型，該損傷模型只需要在胚胎中加入固定劑量的MTZ即可誘導(dǎo)損傷，既保證了每個(gè)胚胎損傷劑量和時(shí)間的一致性，同時(shí)還不會損傷腎小管上皮細(xì)胞以外的任何細(xì)胞，并且可以滿足高通量小分子藥物篩選的數(shù)量需求。

腎臟損傷分子1(KIM-1)是的早期分子標(biāo)志物，其在急性和慢性腎損傷的和哺乳動物近端小管中高表達(dá)[11-12]，近期發(fā)現(xiàn)在斑馬魚條件下，kim-1同樣會在斑馬魚近端小管高表達(dá)。在斑馬魚腎小管中持續(xù)性高表達(dá)kim-1會導(dǎo)致刷狀緣脫落，腎小球率過濾下降，心包水腫和逐漸升高的死亡率。kim-1導(dǎo)致的腎臟損傷與哺乳動物的西羅莫司靶分子(mTOR)信號通路激活相關(guān)，抑制mTOR信號通路可明顯改善kim-1誘導(dǎo)的腎臟損傷和死亡率[13]。利用斑馬魚胚胎進(jìn)行高通量小分子藥物篩選發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿┛擅黠@增加斑馬魚腎臟祖細(xì)胞(progenitor cells)表達(dá)范圍和細(xì)胞數(shù)量[14]。組蛋白去乙?；敢种苿┻€可以促進(jìn)斑馬魚后恢復(fù)[15]，在小鼠缺血再損傷模型中同樣也證實(shí)了組蛋白去乙?；敢种苿┛赏ㄟ^促進(jìn)后再生和修復(fù)，在小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿┻€可以逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化[16]。上述研究表明，斑馬魚和哺乳動物之間的AKI分子機(jī)制，治療靶點(diǎn)以及腎臟再生相似且保守。

綜上所述，本研究基于NTR/MTZ原理成功建立了斑馬魚模型，可用于分子機(jī)制和腎臟再生研究，并有望用于尋找新的潛在治療藥物和靶點(diǎn)。

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