海藻不同方法提取物體外抗病毒活性研究*

陳亞喬，侯 林，崔清華，劉相文，袁 琦，田景振山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

海藻是海產(chǎn)藻類(lèi)的統(tǒng)稱(chēng)，為馬尾藻科植物海蒿子Sargassumpallidum(Turn.)C.Ag或羊棲菜Sargassum fusiforme(Harv.)Setch的干燥藻體，性苦、寒、咸，具有消痰，軟堅(jiān)散結(jié)，利水消腫的功效[1]。相關(guān)研究表明[2-6]，海藻具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等作用。海藻提取物有抑制單純皰疹病毒1型(HSV-1)和柯薩奇病毒B3(COXB3)的作用，本研究在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，增加對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)、柯薩奇病毒(COXB5)、腸道病毒71型(EV71)抗病毒活性研究，以進(jìn)一步了解海藻的抗病毒譜，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 藥品 海藻藥材(購(gòu)買(mǎi)于濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為馬尾藻科植物海蒿子的干燥藻體)；利巴韋林注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1410206811)；阿昔洛韋注射液(亞寶藥業(yè)制藥有限公司，批號(hào)：15062005)。

1.2 宿主細(xì)胞及病毒毒種 RSV、HSV-Ⅰ、COXB5、EV71由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供；人喉癌上皮細(xì)胞(Hep2)、橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，由山東中醫(yī)藥大學(xué)B201泰山學(xué)者工作室保存。

1.3 主要試劑 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：AAJ207653)，含 10%新生牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素，過(guò)濾除菌，分裝置4℃?zhèn)溆?；新生牛血?浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：141013)；PBS磷酸鹽緩沖液(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：AAK2-8442)；EDTA-0.25%胰酶(美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)：1737903)；4，5- 二甲基噻唑 -2，5-二苯基四唑溴化物(MTT，Sigma公司)；乙醇、丙酮均為分析純。

1.4 儀器 HF90型CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；CKX-31型倒置顯微鏡(Olympus公司)；HFsafe-1200TE型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；DW-86L286型-80℃冰箱(海爾公司產(chǎn)品)；Spectra Max M5型酶標(biāo)儀(Molecular Device)。

1.5 方法

1.5.1 供試品溶液的制備

1.5.1.1 水回流提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱(chēng)取40目粉末10.0 g，加入100 mL蒸餾水，回流提取2小時(shí)，濾掉藥渣，取濾液，用離心機(jī)3 000 r/min離心15分鐘。取上清液抽濾，濃縮至20 mL，水浴蒸干，然后轉(zhuǎn)至減壓干燥機(jī)完全干燥得干浸膏，用5%二甲基亞砜(DMSO)配成濃度為0.01 g/mL的溶液，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，存于1.5 mL EP管中，即為海藻水提物供試品溶液。

1.5.1.2 75%乙醇回流提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱(chēng)取60目粉末10.0 g，加入100mL 75%乙醇，之后處理步驟同“1.5.1.1”項(xiàng)下方法，即得海藻醇提物供試品溶液。

1.5.1.3 75%乙醇超聲提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱(chēng)取60目粉末10.0 g，加入100 mL 75%乙醇，常溫下超聲提取30分鐘，之后處理步驟同“1.5.1.1”項(xiàng)下方法，即得海藻醇超聲供試品溶液。

1.5.1.4 丙酮冷浸提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱(chēng)取60目粉末10.0 g，加入100 mL丙酮,密封避光冷浸處理7天，濾掉藥渣，取濾液，用離心機(jī)3 000 r/min離心15分鐘。之后步驟同“1.5.1.1”項(xiàng)下方法，即得海藻丙酮供試品溶液。

1.5.2 病毒毒力的測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化并調(diào)整濃度為 1×105個(gè) /mL，每孔 100 μL接種于96孔板，24小時(shí)后長(zhǎng)成單層，棄培養(yǎng)液，依次加入經(jīng)10倍系列稀釋的待測(cè)病毒液100 μL，每濃度重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀(guān)察24小時(shí)，各孔加5 mg/mL MTT 10 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4小時(shí)后，吸棄染液，加DMSO 100 μL，室溫脫色l0分鐘，震蕩6分鐘，酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒液的半數(shù)感染濃度(TCID50)。

細(xì)胞存活率=各組OD值/正常細(xì)胞OD值×100%

細(xì)胞比距=(高于50%病變率-50%)/(高于50%病變率-低于50%病率)×100%

TCID50=Antilg(Ig高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距×稀釋因子對(duì)數(shù))

1.5.3 待測(cè)藥物的細(xì)胞毒作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板，24小時(shí)后長(zhǎng)成單層，棄培養(yǎng)液，待測(cè)藥物用1640維持液按2倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，依次接種于己經(jīng)長(zhǎng)成單層的細(xì)胞96孔板中，每濃度3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照孔及細(xì)胞對(duì)照孔；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后觀(guān)察細(xì)胞病變程度，找到藥物的最大無(wú)毒濃度(TC0)。MTT染色，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，應(yīng)用Reed-Muench公式計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)及TC0，C為供試品初始濃度。

TC50=[Antilog(log高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距)]×C

1.5.4 海藻提取物體外抗病毒實(shí)驗(yàn)方法 將1×105個(gè)/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞每孔100 μL接種于96孔板，24小時(shí)后長(zhǎng)成單層，棄培養(yǎng)液，分別設(shè)藥物組(100 μL 藥液 +100 μL 病毒液)、細(xì)胞對(duì)照組(200μL維持液)、病毒對(duì)照組 (100μL維持液+100 μL 病毒液)、空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞，100 μL 藥液+100 μL病毒液)，藥物組將藥物從最大無(wú)毒濃度開(kāi)始2倍比系列稀釋11個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)3組，按每孔100 μL依次加入到96孔板中，隨后加入含100個(gè)TCID50的病毒液100 μL，混合均勻。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待病毒對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)90%及以上病變時(shí)采用CPE法記錄藥物抑毒情況，隨后MTT法測(cè)定每孔OD值，應(yīng)用Reed-Muench公式計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度EC50及治療指數(shù)(TI)，C為供試品初始濃度。

EC50=[Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)]×C

治療指數(shù)(TI)=半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)

2 結(jié)果

一般認(rèn)為T(mén)I值≥2，證明藥物有抗病毒活性，TI值≥4，其抗病毒成分有研究?jī)r(jià)值。本研究結(jié)果表明，海藻4種方法提取物對(duì)RSV有不同程度的抑制作用，其中水提物抗RSV活性最高，其TI值為413.00，甚至略高于陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林；乙醇回流提取物也有較好的抗RSV病毒作用，TI值為11.63；乙醇超聲物和丙酮冷浸物抗RSV活性較弱，TI值分別為3.23和3.78。

有文獻(xiàn)報(bào)道[7]海藻有抗HSV-1的活性。本研究結(jié)果表明，海藻4種提取物均有抗HSV病毒活性，其中水提物的治療指數(shù)為310.83，略低于陽(yáng)性對(duì)照藥阿昔洛韋，抗病毒活性較強(qiáng)；其他3種提取物的 TI 值分別為 28.84、4.20、8.06，4 種提取物均有一定的研究?jī)r(jià)值。

海藻水提、乙醇回流提取、乙醇超聲提取3種方法提取物的抗COXB5活性均較弱，乙醇超聲提取物活性稍強(qiáng)，TI值為19.97。

本研究結(jié)果表明，海藻水提物具有較強(qiáng)的抗EV71活性，治療指數(shù)為176.07，其活性?xún)?yōu)于陽(yáng)性藥利巴韋林，另外3種提取物無(wú)抗EV71活性，見(jiàn)表 1—6。

表1 4種病毒的TCID50

表2 待測(cè)藥物的細(xì)胞毒作用TC50 mg/mL

表3 海藻體外抗RSV實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 海藻體外抗HSV-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 海藻體外抗COXB5實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 海藻體外抗EV71實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了海藻對(duì)4種病毒的抗病毒效果，結(jié)果表明，海藻水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)所用4種病毒均有良好的抑制作用。海藻的主要化學(xué)成分有糖類(lèi)、酚類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、萜類(lèi)、黃酮等[8]，本實(shí)驗(yàn)水提物采取加熱回流提取的方式，其中所含化學(xué)成分以糖類(lèi)居多，有實(shí)驗(yàn)表明[9]海藻多糖具有抗HSV-1和COXB3的作用，亦可調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)海藻提取物進(jìn)行了抗病毒活性的初步篩選，為建立海藻抗病毒譜提供依據(jù)，進(jìn)一步研究的主要任務(wù)是找出其主要抗病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及是否與其他成分相互作用以達(dá)到抗病毒效果并確定其抗病毒的作用機(jī)制。

海洋是人類(lèi)的天然寶庫(kù)，海藻作為海洋天然產(chǎn)物中的一大類(lèi)，因?yàn)槠漭^好的生物多樣性而占據(jù)優(yōu)勢(shì)，而且海藻藥理活性豐富，具有很好的研究?jī)r(jià)值。

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