草甘膦和撲草凈對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD和AChE酶活性的影響

宋欣媛，吳培福，吳 博，孫仕仙

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 濕地學(xué)院，云南 昆明 650224)

近年來(lái)農(nóng)藥濫用的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，引發(fā)了各界的廣泛關(guān)注，土壤是人類賴以生存的主要資源，也是生態(tài)環(huán)境重要的組成部分。由于人們的環(huán)保意識(shí)差，在使用上單純的追求殺蟲或除草的效果，擅自提高其使用濃度，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)形成危害。蚯蚓能使土壤變松，并使空氣和水更容易到達(dá)植物的根部，同時(shí)還可以降解和疏散土壤中的污染物。由于蚯蚓所具有的獨(dú)特生物學(xué)特性[1]，學(xué)者們已將其作為土壤環(huán)境污染的指標(biāo)，因此極大地促進(jìn)了蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的發(fā)展[2-3]。本實(shí)驗(yàn)以蚯蚓為主要實(shí)驗(yàn)材料，所研究的內(nèi)容主要通過(guò)OECD規(guī)定的濾紙接觸法[4]，研究除草劑草甘膦和撲草凈單一作用對(duì)蚯蚓的毒性和致死效應(yīng)，并繪制出劑量-效應(yīng)曲線；進(jìn)一步研究蚯蚓體內(nèi)蛋白含量，超氧化物歧化酶(SOD)活力和乙酰膽堿酯酶(AChE)活力在草甘膦和撲草凈單一作用時(shí)的變化，為科學(xué)的評(píng)價(jià)農(nóng)藥安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafoetida)，購(gòu)置于湖南蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)，該品種常用于進(jìn)行蚯蚓毒性試驗(yàn)，對(duì)污染物有中等的敏感性。實(shí)驗(yàn)前需預(yù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇體質(zhì)量均衡，環(huán)帶明顯的蚯蚓個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

95%草甘膦粉劑(昆明農(nóng)藥有限公司)；97%撲草凈粉劑(昆明農(nóng)藥有限公司)；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；乙酰膽堿酯酶(AChE)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 添加農(nóng)藥的方法 草甘膦：稱取0.210 5 g 95%草甘膦放入100 mL容量瓶中，定容至100 mL配置成2 000 mg/L的草甘膦母液。分別吸取母液并用蒸餾水稀釋配置成(1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 mg/L)5個(gè)梯度質(zhì)量濃度。吸取5 mL相應(yīng)濃度的農(nóng)藥均勻地淋灑于墊有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上。

撲草凈：吸取0.010 3 g 97%撲草凈放入100 mL容量瓶中，加入2 mL丙酮助溶，定容至100 mL，配成100 mg/L的撲草凈母液。分別吸取母液并用蒸餾水稀釋配置成(20，40，60，80，100 mg/L)5個(gè)梯度質(zhì)量濃度。吸取5 mL相應(yīng)濃度的農(nóng)藥均勻淋灑于墊有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上。

空白組：草甘膦實(shí)驗(yàn)中，空白組試驗(yàn)吸取5 mL蒸餾水均勻地淋灑于墊有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上。撲草凈實(shí)驗(yàn)中，空白組試驗(yàn)將2 mL丙酮溶于100 mL蒸餾水中混合均勻，然后吸取5 mL溶液均勻地淋灑于墊有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上。

1.3.2 試驗(yàn)前的預(yù)處理和染毒試驗(yàn) 將挑選好的體質(zhì)量均衡的蚯蚓洗凈后，放入裝有己潤(rùn)濕濾紙的1 L大燒杯中，用塑料薄膜封口，并在薄膜上扎孔透氣，置于陰涼的暗處清腸一晝夜，以除去腸道內(nèi)的雜物。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將清腸后的蚯蚓表面沖選干凈，用濾紙吸干其表面水分，每10條蚯蚓放入一個(gè)玻璃培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。為防止蚯蚓逃跑用已扎孔的塑料薄膜將培養(yǎng)皿密封，放置于20 ℃左右、陰涼無(wú)光照的條件下培養(yǎng)，觀察蚯蚓的中毒癥狀及行為(刺激蚯蚓頭部無(wú)明顯反應(yīng)時(shí)認(rèn)為蚯蚓已死亡)，并定時(shí)記錄蚯蚓的死亡率，在染毒期間注意清理死亡蚯蚓以防污染其他蚯蚓。

1.3.3 蛋白含量的測(cè)定 分別在24，48，72 h采集蚯蚓存活樣品，用清水清洗并用濾紙將水吸干，稱量，按質(zhì)量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，放入離心機(jī)2 500 r/min，離心10 min，取上清液，再用生理鹽水按1∶9的比例稀釋成1%的組織勻漿，待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定，加入顯色劑混勻，靜置10 min，于波長(zhǎng)595 nm處，光徑1 cm，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光光度(OD)值。

(1)

1.3.4SOD酶活力測(cè)定 分別在24，48，72 h采集蚯蚓存活樣品，稱量，按質(zhì)量體積比加生理鹽水冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿。在離心機(jī)3 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定，加入試劑盒試劑，混勻，室溫靜置10 min，于波長(zhǎng)550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色，測(cè)各管吸光度值。

(2)

1.3.5AChE活力測(cè)定 分別于24,48 h采集蚯蚓存活樣品，稱量，按質(zhì)量體積比加生理鹽水冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿，2 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液待測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書操作步驟加入各試劑，靜止15 min，波長(zhǎng)412 nm，0.5 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)各管吸光光度(OD)值。

(3)

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，采用Excel和SPSS軟件處理與分析，半致死質(zhì)量濃度(LC50)采用SPSS軟件獲得。所得結(jié)果均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，并用回歸法分析污染的劑量——效應(yīng)關(guān)系，以相關(guān)系數(shù)表明相關(guān)程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦和撲草凈兩種農(nóng)藥單一污染對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)

圖1和圖2中，死亡率隨濃度和時(shí)間的遞增而遞增，72 h時(shí)，兩種農(nóng)藥的高濃度組的死亡率均已接近50%。

圖1 草甘膦對(duì)蚯蚓的劑量-效應(yīng)關(guān)系圖Fig.1 Doseage-response relationship of glyphosate on earthworms

圖2 撲草凈對(duì)蚯蚓的劑量-效應(yīng)關(guān)系Fig.2 Doseage-response relationship of prometryn on earthworms

農(nóng)藥種類Pesticides時(shí)間/hTimeLC50/(mg·L-1)Lethalconcentration5095%置信區(qū)間/(mg·L-1)95%confidenceinterval回歸方程Regressionequation草甘膦(Glyphosate)242206．3671943．412～3174．141y=9E-08x2+2E-05x-0．1271R=0．9751482054．8071816．644～2732．404y=1E-07x2+0．0002x-0．3057R=0．9925721813．8761630．353～2051．368y=-2E-07x2+0．001x-0．7639R=0．9827撲草凈(Prometryn)24145．322115．362～236．368y=-5E-06x2+0．0032x-0．066R=0．992348117．71698．718～160．834y=8E-06x2+0．0026x+0．0039R=0．94767293．37878．296～127．998y=2E-05x2+0．0025x+0．0379R=0．9521

用SPSS軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以得到不同農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的LC50[5]。數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。表1中，不同種農(nóng)藥以及同種農(nóng)藥在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)蚯蚓具有不同的半致死劑量。根據(jù)上表草甘膦和撲草凈對(duì)蚯蚓的LC50值，可知在相同時(shí)間內(nèi)撲草凈對(duì)蚯蚓致死毒性大于草甘膦。采用《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中建議的標(biāo)準(zhǔn)：LC50<1 mg/L為高毒農(nóng)藥，1～10 mg/L為中等毒農(nóng)藥，>10 mg/L為低毒農(nóng)藥[6]，草甘膦和撲草凈對(duì)蚯蚓的毒性值均>10 mg/L，所以兩種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性均為低毒。因此可以認(rèn)為這兩種農(nóng)藥在農(nóng)田中使用對(duì)蚯蚓是相對(duì)安全的。

2.2 農(nóng)藥污染對(duì)蛋白含量的影響

圖3中，在相同時(shí)間內(nèi)，隨草甘膦濃度的上升蚯蚓體內(nèi)的蛋白含量呈明顯的先上升后下降的趨勢(shì)，且24 h時(shí)草甘膦濃度對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響顯著(P<0.05)。同時(shí)觀察相同質(zhì)量濃度不同時(shí)間，蚯蚓體內(nèi)的蛋白含量也是隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。

圖4中，撲草凈的污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響比較復(fù)雜，大致呈現(xiàn)出隨濃度的升高，蚯蚓體內(nèi)蛋白濃度先升高后降低的趨勢(shì)，72 h時(shí)撲草凈的污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響顯著(P<0.05)。而隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量呈現(xiàn)出小幅度的先上升后下降的趨勢(shì)，規(guī)律性不是很明顯。

圖3 草甘膦單一作用對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響Fig.3 Effects of glyphosate on protein contents of earthworm

圖4 撲草凈單一作用對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響Fig.4 Effects of prometryn on protein contents of earthworm

2.2.1 相關(guān)性分析 根據(jù)各圖表可知，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的關(guān)系呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，回歸法分析農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的劑量-效應(yīng)關(guān)系，如表2所示。表2中，由草甘膦和撲草凈兩種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的回歸方程中的相關(guān)系數(shù)可以看出，撲草凈的污染對(duì)蚯蚓蛋白質(zhì)含量的影響高于草甘膦的污染。

表2 農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量影響關(guān)系曲線

2.3 對(duì)SOD酶活力的影響

圖5中，草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的影響較為復(fù)雜。24 h內(nèi)，隨濃度升高SOD酶活性先下降后在1 400 mg/L時(shí)上升到96 U/mgprot再下降；48 h時(shí)，酶活性隨質(zhì)量濃度的增加表現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢(shì)；72 h時(shí)，酶活性隨質(zhì)量濃度的上升表現(xiàn)出先升高后持續(xù)下降的趨勢(shì)。圖6中，在撲草凈的作用下，相同時(shí)間內(nèi)SOD酶活力隨撲草凈的濃度的增加逐漸降低。

2.3.3 相關(guān)性分析 根據(jù)各圖表可知,各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的關(guān)系呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì),回歸法分析農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的劑量-效應(yīng)關(guān)系如表3所示，表3中展示了草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性影響的回歸方程中的相關(guān)系數(shù)，在草甘膦的污染下，72 h時(shí)對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的影響大于24 h和48 h；草甘膦和撲草凈兩種農(nóng)藥比較之下，撲草凈對(duì)蚯蚓SOD酶的影響大于草甘膦。

圖5 草甘膦單一作用對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活力的影響Fig.5 Effect of glyphosate on SOD activity of earthworms

圖6 撲草凈單一作用對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活力的影響Fig.6 Effect of prometryn on SOD activity of earthworms

時(shí)間/hTime草甘膦Glyphosate撲草凈Prometryn24y=-1E-05x2+0．0121x+78．24R=0．365y=-0．0011x2-0．2531x+81．346R=0．96148y=-1E-05x2+0．0305x+79．029R=0．612y=0．0032x2-0．7986x+111．21R=0．99472y=-3E-05x2+0．0395x+69．983R=0．962y=0．0017x2-0．4824x+85．548R=0．994

2.4 蚯蚓體內(nèi)的AChE酶活力

2.4.1 草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE酶活力的影響 圖7可見(jiàn)，草甘膦污染下，各質(zhì)量濃度時(shí)蚯蚓體內(nèi)的AChE酶活力均明顯小于空白對(duì)照組，說(shuō)明草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)的AChE酶活力為抑制作用。

圖8中可見(jiàn)，各質(zhì)量濃度的撲草凈中蚯蚓體內(nèi)的AChE酶活力均小于空白對(duì)照組，說(shuō)明撲草凈對(duì)蚯蚓體內(nèi)的AChE酶活力也為抑制作用。而隨撲草凈濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)AChE酶活力有持續(xù)升高的趨勢(shì)。

圖7 草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE酶活力的影響Fig.7 Effect of Glyphosate on AChE activity of earthworms

圖8 撲草凈對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE酶活力的影響Fig.8 Effect of Prometryne on AChE activity of earthworms

2.4.3 相關(guān)性分析 表4可見(jiàn)，撲草凈和草甘膦的污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE酶活力影響的相關(guān)性高，且草甘膦的相關(guān)系數(shù)大于撲草凈的相關(guān)系數(shù)，所以草甘膦污染的相關(guān)性大于撲草凈。

表4 兩種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE酶活力的回歸方程

3 討 論

3.1 草甘膦和撲草凈兩種農(nóng)藥單一作用對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)

由于不同種類型的農(nóng)藥具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，所以不同農(nóng)藥所引起的蚯蚓中毒癥狀不同，有機(jī)磷除草劑對(duì)蚯蚓具有較顯著的生長(zhǎng)毒性影響。研究表明：莎稗磷原藥和草銨磷原藥等13種除草劑可以使蚯蚓出現(xiàn)扭曲、伸長(zhǎng)、變軟、環(huán)帶腫大充血、身體糜爛斷裂等癥狀[7]。毒死蜱暴露8周后對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)有不利影響[8]，而氯氰菊酯，百草枯中毒的典型癥狀之一就是蚯蚓體質(zhì)量下降[9-10]。許多農(nóng)藥在低濃度下還能對(duì)蚯蚓的繁殖產(chǎn)生抑制作用[9]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)草甘膦單一污染后蚯蚓身體極度扭曲，身體表面滲出黃色液體，環(huán)節(jié)腫大甚至出現(xiàn)糜爛的現(xiàn)象，而撲草凈污染后蚯蚓身體極度拉伸，甚至因?yàn)闃O度拉長(zhǎng)出現(xiàn)身體斷節(jié)的現(xiàn)象，身體表面滲出紅色液體，頭部和尾部出現(xiàn)膨大，并伴有惡臭。

3.2 草甘膦和撲草凈對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響

草甘膦和撲草凈對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量大致表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，相比之下草甘膦的趨勢(shì)比較簡(jiǎn)單明顯而撲草凈的相對(duì)復(fù)雜。在草甘膦的污染下，蚯蚓體內(nèi)的蛋白含量隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出比較明顯的先上升后下降的趨勢(shì)。在撲草凈的污染下，蚯蚓體內(nèi)的蛋白含量隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出小幅度的先上升后下降的趨勢(shì)，規(guī)律性不是很明顯。出現(xiàn)該情況可能是由于蚯蚓染毒后，機(jī)體功能受到損傷，內(nèi)環(huán)境紊亂，代謝活動(dòng)出現(xiàn)異常，同時(shí)在污染的情況下，蚯蚓處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，使得總蛋白含量有所增加。隨濃度的增加和染毒時(shí)間的推移，經(jīng)皮毒性加強(qiáng)，蚯蚓體內(nèi)蛋白的生成來(lái)源遭到破壞，從而影響蛋白的合成，使總蛋白含量降低[11-12]，而撲草凈污染下的蛋白含量與草甘膦污染下的蛋白含量變化幅度比較，幅度較小的原因可能是由于農(nóng)藥的作用機(jī)理有所不同[13]，而且生物體內(nèi)的蛋白含量受多種因素變化的影響。

3.3 草甘膦和撲草凈對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的影響

草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性影響較復(fù)雜，且規(guī)律性不明顯，24 h低濃度時(shí)酶活性小幅度下降可能是因?yàn)椴莞熟橛袡C(jī)磷除草劑，主要靠胃毒作用對(duì)蚯蚓產(chǎn)生毒害，使得對(duì)蚯蚓的SOD酶活力影響不大，另外由于農(nóng)藥自身的揮發(fā)、分解等作用，使低濃度組的SOD酶活力降低。隨著時(shí)間推移，經(jīng)皮毒性加強(qiáng)，胃毒作用開始發(fā)揮，機(jī)體為了維持自身氧化平衡，SOD酶被激發(fā)，使蚯蚓體內(nèi)SOD酶活力開始出現(xiàn)上升趨勢(shì)；48 h時(shí)，酶活性隨草甘膦濃度的增加表現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢(shì)，先升高的原因可能是因?yàn)闄C(jī)體為了維持自身的氧化平衡激發(fā)了體內(nèi)的SOD酶，而后出現(xiàn)下降的原因可能是因?yàn)轵球窘佑|草甘膦污染后，蚯蚓機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞，隨著農(nóng)藥濃度的升高，機(jī)體受損程度增強(qiáng)，體內(nèi)的自穩(wěn)機(jī)制被打亂，而導(dǎo)致SOD酶活力下降；72 h時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的SOD酶活力隨草甘膦濃度的上升表現(xiàn)出先升高后持續(xù)下降的趨勢(shì)，可能是由于蚯蚓機(jī)體嚴(yán)重受損，導(dǎo)致SOD酶活力持續(xù)下降；而撲草凈的污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)的SOD酶活性的影響比較明顯，相同時(shí)間的情況下，蚯蚓體內(nèi)的SOD酶活性隨著撲草凈濃度的升高呈明顯的下降趨勢(shì)，而相同濃度不同時(shí)間方面觀察，SOD酶活性呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，出現(xiàn)這種情況所可能的原因是，蚯蚓接觸撲草凈后，對(duì)機(jī)體造成損害，而隨著脅迫強(qiáng)度的增強(qiáng)，機(jī)體受損程度也隨之增強(qiáng)，使體內(nèi)自穩(wěn)機(jī)制紊亂，而導(dǎo)致酶活力下降。從相同濃度不同時(shí)間方面觀察，酶活性呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)?？赡艿脑蚴牵谕N濃度的污染下，蚯蚓機(jī)體為了維持自身的氧化平衡激發(fā)了體內(nèi)的SOD酶[14]，從而導(dǎo)致在48 h時(shí)酶活性同比高于24 h時(shí)的酶活性，而72 h時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的SOD酶活性相比于48 h時(shí)有所降低，可能是因?yàn)閾洳輧舻奈廴驹斐闪蓑球緳C(jī)體的損傷，致使SOD酶活性降低。

3.4 草甘膦和撲草凈對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE酶活性的影響

兩種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE酶活力均為抑制作用，孫維等[15]研究表明呋喃丹對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE活性也具有較強(qiáng)抑制作用。但因農(nóng)藥的作用機(jī)理不同，所以抑制作用也不同。草甘膦屬于有機(jī)磷類除草，其作用機(jī)理是抑制膽堿酯酶活性，使膽堿酯酶失去分解乙酰膽堿的能力，因而乙酰膽堿在體內(nèi)積蓄過(guò)多而中毒[16]，從而導(dǎo)致生理失調(diào)。但如果草甘膦在蚯蚓體內(nèi)水解后，酶的活性能夠得到一定的恢復(fù)，這可能是AChE酶活力有上升趨勢(shì)的原因[13]。撲草凈屬于三嗪類選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，主要作用于乙酰膽堿受體，抑制神經(jīng)傳導(dǎo)而使蚯蚓處于麻痹癱瘓狀態(tài),從而導(dǎo)致死亡。所以該農(nóng)藥對(duì)AChE酶沒(méi)有較強(qiáng)的抑制作用，而是作用于乙酰膽堿受體最終導(dǎo)致死亡。

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