免疫磁珠分離技術(shù)聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測ENU致大鼠體內(nèi)Pig-a基因突變

秦美蓉，鄭丹丹，黃澤愉，王曉煒，李俊鵬，王平

(深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057)

Pig-a基因是機(jī)體合成糖化磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI)的關(guān)鍵基因，Pig-a基因突變導(dǎo)致細(xì)胞表面CD59、CD55、CD48等GPI錨連蛋白缺失[1-2]。Pig-a基因存在于X染色體上，結(jié)構(gòu)高度保守，人和不同動(dòng)物種屬的Pig-a基因具有同源性。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠外周血紅細(xì)胞突變表型率(RETCD59-、RBCCD59-)可以檢測大鼠Pig-a基因突變情況，根據(jù)這個(gè)原理，近年來國外建立了一種新的基因突變試驗(yàn)，即體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)，用于化學(xué)品的遺傳毒性評價(jià)[3-4]。由于大鼠外周血紅細(xì)胞Pig-a基因突變率很低，直接分析法需要檢測大量的外周血細(xì)胞(1×106以上)，樣本檢測時(shí)間很長，并且容易出現(xiàn)檢測結(jié)果為0的情況[5]。本研究旨在利用抗原抗體特異性結(jié)合原理和磁性吸附原理，參考Litro Labs網(wǎng)站[6]及Dertinger等[5]方法，運(yùn)用免疫磁珠分離技術(shù)去除野生型RETs和RBCs，從而使突變型細(xì)胞得到富集，擴(kuò)大目標(biāo)細(xì)胞檢測數(shù)量，縮短流式細(xì)胞儀的檢測時(shí)間，進(jìn)一步提高Pig-a基因突變試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和檢測效率。

目前，Pig-a基因突變試驗(yàn)四個(gè)階段的國際聯(lián)合驗(yàn)證已經(jīng)基本完成[7]。2014年，人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)議(International Council for Harmonization，ICH)M7指南將Pig-a基因突變試驗(yàn)納入體外突變陽性結(jié)果的后續(xù)試驗(yàn)中[8]。2015年5月，該試驗(yàn)方法被批準(zhǔn)開始經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)指導(dǎo)原則起草工作，預(yù)計(jì)2020年完成OECD指導(dǎo)原則制定[9]。我國已于2017年5月正式加入ICH，積極開展遺傳毒性新方法研究，有利于提高我們在ICH指導(dǎo)原則修訂上的話語權(quán)。要將該方法引入到我國的標(biāo)準(zhǔn)體系，應(yīng)用到藥物、化妝品及食品的安全性評價(jià)中，需要根據(jù)我國國情，對方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證。張銘等[10]使用美國Litro實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒及分析軟件進(jìn)行了該方法的高通量研究。本研究使用可以方便獲得的試劑，運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行結(jié)果分析，拓寬了實(shí)驗(yàn)條件，降低了研究門檻，是對國際驗(yàn)證很好的補(bǔ)充，可以為國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室開展聯(lián)合驗(yàn)證、推廣及建立我國標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(粵)2013-0002】。飼養(yǎng)于深圳市藥品檢驗(yàn)研究院屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(粵)2015-0157】，飼養(yǎng)期間給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)及滅菌城市生活用水。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，濕度40%～70%，12 h晝夜明暗交替。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 受試物

N-乙基-N-亞硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)，CAS號：759-73-9，Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑和儀器

PE Mouse Anti-Rat CD59，BD公司；PE anti-rat CD61 Antibody, Biolegend公司；抗PE微珠，德國美天旎公司；絕對計(jì)數(shù)珠和SYTO13核酸染料，Invitrogen公司；哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞分離液，加拿大Cedarlane公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。FC500流式細(xì)胞儀，美國貝克曼庫爾特公司；磁力分離器(QuadroMACSTMSeparator)，德國美天旎公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物染毒

大鼠適應(yīng)環(huán)境5 d后隨機(jī)分為4組，分別為：溶劑對照組、ENU三個(gè)劑量組：20、40、80 mg/ (kg·bw)，低、中、高劑量組分別灌胃不同濃度的ENU溶液，對照組灌胃滅菌水，灌胃體積10 mL/ (kg·bw)。每天灌胃1次，連續(xù)3 d。

1.2.2 溶液配制

用稀釋液1(含2%胎牛血清的PBS)稀釋抗體，制備含PE-Anti-CD59(終濃度10 μg/mL)和PE-Anti-CD61(終濃度0.25 μg /mL)的抗體溶液。用稀釋液1將抗PE磁性微珠稀釋5倍，制備磁珠分離液。用稀釋液1制備含有核酸染料(終濃度稀釋1000倍)和計(jì)數(shù)微球(終濃度稀釋30倍)的混合染液。

1.2.3 血樣采集及分離

于受試物灌胃前1 d和灌胃后第7、14、28天尾靜脈采血，每只動(dòng)物取120 μL 血液與肝素鈉溶液混勻，加入至1.5 mL淋巴細(xì)胞分離液中，800 g離心20 min，吸去上清，按140 μL/樣本加入預(yù)冷的PBS溶液，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL稀釋液1中，混勻，240 g離心10 min，去除上清，按140 μL /樣本加入預(yù)冷的PBS溶液，混勻后2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 抗體標(biāo)記

取160 μL分離好的血樣加入到100 μL抗體溶液中，混勻，在2～8℃避光孵育30 min，轉(zhuǎn)移到1.5 mL預(yù)冷的稀釋液1中，340 g離心5 min，去除上清。

1.2.5 抗PE微珠孵育

往1.2.4制備的每個(gè)樣品中加入100 μL磁珠分離液，吹勻，2～8℃避光孵育15 min,加入1.5 mL稀釋液1，吹勻，340 g離心5 min，去除上清。

1.2.6 柱前樣品染色

往1.2.5制備的樣品中加入1.0 mL預(yù)冷的稀釋液1，輕輕吹勻，取10 μL到990 μL混合染液中，37℃避光孵育15 min，用于柱前樣本流式細(xì)胞檢測。

1.2.7 免疫磁珠分離

安裝免疫磁珠分離器，用3 mL預(yù)冷的稀釋液1預(yù)濕分離柱，待穩(wěn)定后，將1.2.6中剩余的柱前未染色樣品重懸后，加入900 μL到分離柱中，加入5 mL稀釋液1清洗柱子，收集洗脫液，800 g離心5 min，去除上清，得到柱后樣品約50 μL，加入300 μL混合染液重懸，轉(zhuǎn)移到流式管中，37℃避光孵育15 min，用于柱后樣本流式細(xì)胞檢測。

1.2.8 儀器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(instrument calibration standard，ICS)制備

取1.2.3中分離后得到的對照組樣本20 μL，用200 μL稀釋液1重懸，取5 μL到500 μL混合染液中，混勻，37℃避光孵育15 min，得A液，模擬突變細(xì)胞。1.2.6中孵育后的對照組樣本為B液，模擬正常細(xì)胞。將A液和B液等體積混合，即為ICS。

1.2.9 流式細(xì)胞檢測

使用ICS調(diào)節(jié)電壓和熒光補(bǔ)償，F(xiàn)ITC通過FL1通道檢測，PE通過FL2通道檢測。對各組的柱前樣本和柱后樣本分別進(jìn)行流式分析，檢測樣本中網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocytes，RET)、正染紅細(xì)胞(Normochromatic Erythrocyte，NCE)、突變型網(wǎng)織紅細(xì)胞(RETCD59-)和突變型成熟紅細(xì)胞(NCECD59-)的數(shù)量。

1.2.10 數(shù)據(jù)計(jì)算

根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，參考Litro Labs網(wǎng)站[6]及Dertinger等[5]的方法，計(jì)算樣品中RET百分率(RET%)、RETCD59-和RBCCD59-的發(fā)生率，其中RBC為總紅細(xì)胞，RBC=RET+NCE，Pig-a基因突變率以每1×106個(gè)細(xì)胞中發(fā)生突變的細(xì)胞數(shù)目表示。計(jì)算公式如下：

(1)樣品體積及稀釋數(shù)據(jù)

a=標(biāo)記抗體的血液總體積(μL)

b=柱前血樣體積(μL)

c=柱前染液體積(μL)

d=柱后剩余血樣體積(μL)

e=柱后血樣染液體積(μL)

f=細(xì)胞稀釋因子=(b+ c) / b

g=細(xì)胞濃度因子=(a- b) / (d +e)

h=絕對計(jì)數(shù)珠稀釋因子=(e×100) / (d + e)

(2)柱前數(shù)據(jù)

i=UL

j=UR

k=LL

l=LR

m=絕對計(jì)數(shù)珠

n=柱前RET: 絕對計(jì)數(shù)珠=(i + j)/m

o=柱前RBC: 絕對計(jì)數(shù)珠=(i + j + k + l)/m

p=% RET=(i + j) / (i + j + k + l)×100

(3)柱后數(shù)據(jù)

q=UL

r=LL

s=絕對計(jì)數(shù)珠

(4)基于柱前和柱后數(shù)據(jù)計(jì)算

t=總RET當(dāng)量=n×s×f×g×100/h

u=總RBC當(dāng)量=o×s×f×g×100/h

v=每106個(gè)總RETs中突變RETs數(shù)量=q / t×(106)

w=每106個(gè)總RBCs中突變RBCs數(shù)量=(q + r) / u×(106)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞檢測方法的建立及優(yōu)化

使用ICS調(diào)校流式細(xì)胞儀電壓和熒光補(bǔ)償，左下象限的Y軸熒光強(qiáng)度幾何均值與右下象限差值<0.1，左上象限的X軸熒光強(qiáng)度幾何均值與左下象限的差值<0.1，大鼠外周血中RET、NCE、RETCD59-和NCECD59-四種細(xì)胞群能明顯區(qū)分，見圖1A。樣本經(jīng)過免疫磁珠分離后，去除了大量的野生型細(xì)胞，流式細(xì)胞儀捕獲到的突變細(xì)胞數(shù)RETCD59-和NCECD59-從柱前樣本的102數(shù)量級增加到104數(shù)量級，大幅提高了檢測方法的準(zhǔn)確性。見圖1B和圖1C。

注：A: 使用含有標(biāo)記及未標(biāo)記PE-Anti-CD59的樣本混合溶液作為儀器校驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，調(diào)節(jié)電壓和熒光補(bǔ)償，四種細(xì)胞得以明顯區(qū)分開。B: 采集血樣進(jìn)行柱前分析，血樣來自ENU中劑量組的大鼠，染毒后第14天采血，分析1×106個(gè)細(xì)胞，分析時(shí)間為8 min。C：采集與圖B同一只大鼠的外周血，分析2×105個(gè)細(xì)胞，分析時(shí)間為3 min。圖中四個(gè)象限分別代表：左上象限(UL)為RETCD59-；右上象限(UR)為RETCD59+；左下象限(LL)為NCECD59-；右下象限(LR)為NCECD59+。圖1 FITC-PE通道的二維散點(diǎn)圖Note. A. A mixture of PE-anti-CD59-labeled and -unlabeled cells was used as the instrument calibration standard (ICS) to calibrate the instrument, and to adjust the photomultiplier tube (PMT) voltage and fluorescence compensation, the four types of cells could be clearly distinguished. B. Blood samples of the ENU middle dose group were collected on the 14th day after treatment for pre-column analysis. The number of cells was 1×106 and the analysis time was 8 min. C: Blood sample from the same rat of the panel B was collected, and the post-column analysis of 2×105 cells was performed for 3 min. The four quadrants in the figure represent respectively: left upper quadrant (UL) is RETCD59-; right upper quadrant (UR) is RETCD59 +; left lower quadrant (LL) is NCECD59-; and right lower quadrant (LR) is NCECD59 +.Fig.1 Representative bivariate dot plots ilustrating the distribution of four FITC-PE fluorescent cell populations

2.2 大鼠外周血RET%檢測結(jié)果

給予ENU后，各組大鼠RET%隨時(shí)間延長而降低，與對照組相比差異均無顯著性(P>0.05)。圖2。

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05，n=5。圖2 大鼠外周血RET%隨時(shí)間和劑量的變化Note.*P<0.05, compared with the control group, n=5.Fig.2 Changes of the percentage of Peripheral blood RET% with time and dose

2.3 大鼠外周血RETCD59-發(fā)生率檢測結(jié)果

大鼠連續(xù)給予NEU 3 d后，除低劑量組第7 天外，ENU各劑量組大鼠在給藥后各檢測時(shí)點(diǎn)RETCD59-率均顯著高于對照組(P<0.05)。各劑量組大鼠RETCD59-率在第14天達(dá)到最高值，分別為溶劑對照組的1.7倍、3.6倍、5.7倍，隨后下降。圖3。

注：與溶劑對照組比較，*P <0.05，n=5。圖3 大鼠外周血RETCD59-的發(fā)生率隨時(shí)間和劑量的變化Note.*P<0.05, compared with the control group, n=5.Fig.3 Changes of the frequency of Peripheral blood RETCD59- with time and dose

2.4 大鼠外周血RBCCD59-發(fā)生率檢測結(jié)果

大鼠連續(xù)給予NEU 3 d后， ENU各劑量組大鼠在給藥后各檢測時(shí)點(diǎn)外周血RBCCD59-率均顯著高于對照組(P<0.05)。在第28天低、中、高劑量組大鼠RBCCD59-率測得值最高，分別為溶劑對照組的3.0倍、5.4倍、9.2倍。見圖4。

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05，n=5。圖4 大鼠外周血RBCCD59-的發(fā)生率隨時(shí)間和劑量的變化Note.*P<0.05, compare with the control group, n=5.Fig.4 Change of the frequency of Peripheral blood RBCCD59- with time and dose

3 討論

免疫磁珠分離技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的的一項(xiàng)與磁載體結(jié)合的免疫學(xué)技術(shù)，它同時(shí)具備了免疫學(xué)反應(yīng)的高度專一性以及固相化試劑所特有的優(yōu)點(diǎn)，對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行富集，廣泛應(yīng)用于稀有細(xì)胞的檢測[11-13]。本研究用PE-Anti-CD59抗體對野生型RET和RBC進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)記后的細(xì)胞與抗PE磁性微珠結(jié)合，通過磁場分選裝置時(shí)，野生型RET和野生型RBC被截留，從而使突變型RBCCD59-和突變型RETCD59-的濃度大幅提高。柱后樣本無法直接測出RET和RBC總數(shù)，本研究使用絕對計(jì)數(shù)微球，柱前樣本和柱后樣本中分別加入絕對計(jì)數(shù)微球后再進(jìn)行流式細(xì)胞分析，根據(jù)柱前、柱后樣本中RET和RBC與絕對計(jì)數(shù)微球的比例，計(jì)算出柱后樣本RET和RBC當(dāng)量，進(jìn)而得出柱后樣本RBCCD59-率和RETCD59-率。本研究利用免疫磁珠分離技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，檢測的RET和RBC目標(biāo)細(xì)胞數(shù)可達(dá)直接流式檢測時(shí)的100倍，檢測時(shí)間由原來的8 min縮短為3 min。優(yōu)化后的方法提高了樣本中Pig-a基因突變細(xì)胞的分析數(shù)量和結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高了檢測效率和儀器使用壽命。此外，本研究采用淋巴細(xì)胞分離液去除了大部分的淋巴細(xì)胞，再用PE-Anti-CD61抗體標(biāo)記樣本，在免疫磁珠分離步驟中進(jìn)一步去除血小板，排除非目標(biāo)細(xì)胞粒子的影響，降低背景突變率。

ENU是一種較強(qiáng)的基因突變誘變劑，能導(dǎo)致多種生物隨機(jī)、單堿基突變的發(fā)生，在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生大量的隨機(jī)突變表型[14]，是致突變試驗(yàn)中常用的陽性誘變劑。本研究結(jié)果顯示，ENU經(jīng)口連續(xù)給予大鼠3 d后，RBCCD59-率在試驗(yàn)周期內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，RETCD59-率在第14天可見明顯下降。由此可見，Pig-a基因突變在RET細(xì)胞中較早發(fā)生，并且在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到高峰，用RET作為目標(biāo)檢測細(xì)胞，可以縮短試驗(yàn)周期。Kimoto等[15]建立了PIGRET方法，利用免疫磁珠法富集大鼠外周血RET細(xì)胞，對突變型細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，可以減少數(shù)據(jù)分析的工作量，縮短試驗(yàn)周期。日本MMS/JEMS(日本環(huán)境基因突變學(xué)會(huì)哺乳動(dòng)物基因突變研究組)組織16個(gè)實(shí)驗(yàn)室對PIGRET方法進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果認(rèn)為PIGRET是一種很好的短期體內(nèi)遺傳毒性檢測方法[16]。

新的ICH遺傳毒性指導(dǎo)原則更加重視體內(nèi)遺傳毒性數(shù)據(jù)[17]，將Pig-a基因突變試驗(yàn)整合到28 d重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)中，采血量少，對動(dòng)物傷害小，既與ICH的要求一致，又符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”原則[18-19]；本試驗(yàn)取樣時(shí)間設(shè)計(jì)靈活，可以同時(shí)進(jìn)行受試物體內(nèi)遺傳毒性劑量關(guān)系和時(shí)效關(guān)系的研究，與傳統(tǒng)遺傳毒性試驗(yàn)相比，可以獲得更加全面的信息。在直接使用流式細(xì)胞儀分析Pig-a基因突變的基礎(chǔ)上，采用免疫磁珠分離技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，解決了目標(biāo)突變細(xì)胞數(shù)目少的問題，實(shí)現(xiàn)了大鼠外周血Pig-a基因突變快速、準(zhǔn)確、簡便的高通量分析目標(biāo)[20]。本研究使用自主組合的試劑，利用儀器自帶軟件，建立了優(yōu)化的Pig-a基因突變試驗(yàn)方法，拓寬了試驗(yàn)條件，有利于該方法在國內(nèi)更好地推廣。下一步我們擬使用該方法，對弱致突變劑的遺傳毒性進(jìn)行研究，以擴(kuò)充試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫，為制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案和相關(guān)的指導(dǎo)原則提供更多的數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)(References)

[1] Takahashi M, Takeda J, Hirose S, et al. Deficient biosynthesis of N-acetylglucosaminyl-phosphatidylinositol, the first intermediate of glycosyl phosphatidylinositol anchor biosynthesis，in cell lines established from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria [J]. J Exp Med, 1993, 177(2): 517-521．

[2] Kawagoe K, Takeda J, Endo Y, et al. Molecular cloning of murine pig-a, a gene for GPI-anchor biosynthesis, and demonstration of interspecies conservation of its structure function, and genetic locus [J]. Genomics, 1994, 23 (3): 566-574.

[3] Schuler M, Gollapudi BB, Thybaud V, et al．Need and potential value of the Pig-a in vivo mutation assay — a HESI perspective [J]. Environ Mol Mutagen, 2011, 52(9): 685-689．

[4] Miura D, Dobrovolsky VN, Kimoto T, et al. Accumulation and persistence of Pig-A mutant peripheral red blood cells following treatment of rats with single and split doses of N-ethyl-N-nitrosourea [J]. Mutat Res, 2009, 677(1-2): 86-92.

[5] Dertinger SD, Bryce SM, Phonethepswath S, et al. When pigs fly: immunomagnetic separation facilitates rapid determination of Pig-a mutant frequency by flow cytometric analysis [J]. Mutat Res, 2011, 721(2): 163-170.

[6] Rat Muta Flow PLUS Kit (Plate-Based Processing) http:// litronlabs. com/in_vivo_mutation_publications.html

[7] Revollo J, Pearce MG, Petibone DM, et al. Confirmation of Pig-a mutation in flow cytometry-identified CD48-deficient T-lymphocytes from F344 rats [J]. Mutagenesis, 2015, 30(3): 315-324.

[8] ICH Harmonised Tripartite Guideline M7. 2014. Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk. Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Multidisciplinary/M7/M7_R1_Addendum_Step_4_2017_0331.pdf

[9] 常艷，周長慧，張銘, 等. 體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)的研究進(jìn)展 [C]. 中國毒理學(xué)會(huì)第七次全國毒理學(xué)大會(huì)暨第八屆湖北科技論壇論文集. 2015:113-114.

Chang Y, Zhou CH, Zhang M, et al.Pig-amutation test：a review of recent studies [C]. Proceedings of the 7thNational Congress of Toxicology, Chinese Society of Toxicology and the 8thHubei Society and Technology Forum. 2015: 113-114.

[10] 張銘，周長慧，常艷，等. 體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)高通量方法聯(lián)合驗(yàn)證研究 [J]. 癌變 畸變 突變, 2013, 25(5): 392-395.

Zhang M, Zhou CH, Chang Y, et al. Interlaboratory transferability study of thePig-amutation assay with immunomagnetic enrichment [J]. Carcinog Teratog Mutag, 2013, 25(5):392-395.

[11] Corchero JL, Villaverde A. Biomedical applications of distally controlled magnetic nanoparticles [J]. Trends Biotechnol, 2009, 27(8): 468-476．

[12] Wang GY, Li L, Yu YM, et al. Detection of disseminated tumor cells in bone marrow of gastric cancer using magnetic activated cell sorting and fluorescent activated cell sorting [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2009, 24(2): 299-306.

[13] 邱林，杜娟，王海燕，等. 利用微流控免疫磁珠分選儀高效富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38(6): 634-637.

Qiu L, Du J, Wang HY, et al. Efficient enrichment of circulating tumor cells from peripheral blood by microfluidic immunomagnetic bead sorter [J]. Acta Acad Med Mil Tert, 2016, 38(6): 634-637.

[14] 孫巖松，楊曉. ENU 誘導(dǎo)點(diǎn)突變—大規(guī)?；蛲蛔兒凸δ苎芯?[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2011, 17(4): 365-370.

Sun YS, Yang X. ENU induced mutagenesis-large-scale study of gene mutagenesis and function [J]. Chin J Biotech, 2001, 17(4): 365-370.

[15] Kimoto T, Chikura S, Suzuki K, et al. Further development of the rat Pig-a mutation assay: measuring rat Pig-a mutant bone marrow erythroids and a high throughput assay for mutant peripheral blood reticulocytes [J]. Environ Mol Mutagen, 2011,52 (9): 774-783.

[16] Kimoto T, Horibata K, Miura D, et al. The PIGRET assay, a method for measuring Pig-a gene mutation in reticulocytes, is reliable as a short-term in vivo genotoxicity test: Summary of the MMS/JEMS-collaborative study across 16 laboratories using 24 chemicals [J]. Mutat Res, 2016, 811: 3-15.

[17] ICH. Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use [EB/OL]. [2011-11-09]. http://www.ich.org/products/guidelines/safety/article/safety- guidelines.html.

[18] Stankowski LF Jr, Aardema MJ, Lawlor TE, et al. Integration of Pig-a, micronucleus, chromosome aberration, and comet assay endpoints in a 28-day rodent toxicity study with urethane [J]. Mutagenesis, 2015, 30(3): 335-342.

[19] 施暢，馬華智，王全軍，等. 化學(xué)物(藥物)毒性測試替代體系的建立及應(yīng)用 [J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2017，27(5): 6-8.

Shi C, Ma HZ, Wang QJ, et al. Establishment and application of toxicity testing alternative system for chemicals (new drugs)[J]. Chin J Comp Med, 2017, 27(5): 6-8.

[20] Dertinger SD, Phonethepswath S, Avlasevich SL, et al. Efficient monitoring of in vivo Pig-a gene mutation and chromosomal damage: summary of 7 published studies and results from 11 new reference compounds [J]. Toxicol Sci, 2012, 130(2): 328-348.