野菊莖葉多糖微波輔助法提取工藝及抗氧化活性研究

劉存芳

吳 睿

趙 樺

田光輝

(陜西理工大學(xué)陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 漢中 723000)

野菊(ChrysanthemumindicumL.)又稱為苦薏、野黃菊、路邊黃等，是菊科的一種多年生草本植物，廣泛分布于中國(guó)西南、華南、華中、華北及東北各地，秦嶺山地和大巴山區(qū)盛產(chǎn)野菊[1]。野菊花是野菊的頭狀花序，能治療風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛等病癥[2-4]，野菊花中含有萜類和揮發(fā)油[5-6]、多糖和糖苷[7]、氨基酸和蛋白質(zhì)、黃酮[8]、黃色素以及營(yíng)養(yǎng)元素等成分[9-10]，其中野菊花的質(zhì)量檢驗(yàn)是以蒙花苷含量作為指標(biāo)[11]，已將野菊花應(yīng)用于藥品、食品、化妝品、保健品等行業(yè)。在收集和加工野菊花的過程中會(huì)有大量的野菊莖葉產(chǎn)生，這些野菊莖葉中含有和野菊花相同的活性成分[12]，其莖葉的開發(fā)利用研究還較少[13]，野菊莖葉中多糖的研究更少[14]。有對(duì)野菊同屬植物莖葉中多糖提取的文獻(xiàn)報(bào)道[15]，其多糖提取方法有熱水浸提法、稀堿溶液加熱提取法、纖維素酶輔助提取法、超聲輔助提取法、水浴回流提取法等，熱水浸提和水浴回流一般需要2 h或更長(zhǎng)時(shí)間，超聲輔助提取也需要0.5 h以上，而已用于植物多糖的微波提取只需要10～20 min，微波提取有加熱均勻、用時(shí)少、節(jié)省溶劑、耗能低等特點(diǎn)，且微波輔助提取野菊多糖的研究報(bào)道尚少。用微波輔助法提取野菊莖葉多糖可克服提取時(shí)間長(zhǎng)、加熱不均勻的缺陷，對(duì)微波輔助提取野菊莖葉多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，探索工業(yè)化生產(chǎn)的提取技術(shù)。

本研究擬借助微波輔助法提取野菊莖葉中的多糖，以多糖的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖的提取工藝，通過DEAE-纖維素柱分離純化多糖，并測(cè)試野菊莖葉多糖的抗氧化活性，旨在為野菊莖葉的綜合利用以及野菊莖葉多糖的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

野菊的莖葉：在2015年10月下旬收集于秦巴山區(qū)，由陜西理工大學(xué)省級(jí)植物學(xué)學(xué)科負(fù)責(zé)人趙樺教授鑒定，確定是菊科菊屬植物野菊(ChrysanthemumindicumL.)的莖葉。摘除野菊莖葉上的雜草腐葉，置于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎過200目篩，密封備用；

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醚、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、氯仿、正丁醇、VC、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、磷酸等：分析純，西安化學(xué)試劑廠；

水：二次蒸餾水，自制；

質(zhì)量百分比6%苯酚溶液和0.01%過氧化氫溶液、0.75 mmol 鄰二氮菲溶液、0.75 mmol硫酸亞鐵溶液、PBS溶液為pH=7.4的磷酸緩沖溶液、DPPH溶液為0.1 mmol/mL的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼的乙醇溶液：臨時(shí)配制。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì)：UV-6300PC型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

SINEO萃取儀：UWave-1000型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-III型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

索氏提取器：50～500 mL，天津市世博偉業(yè)化玻儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的提取量[16]，以葡萄糖作為基準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取10.000 mg葡萄糖定容于10 mL容量瓶中配成1 mg/mL的葡萄糖溶液。精確移取葡萄糖溶液和水于8支10 mL的具塞比色管，用水補(bǔ)足2 mL，配成濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16 mg/mL的溶液，再精確加入3 mL苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，80 ℃水浴保溫20 min，取出冷卻至室溫，以水為空白，在490 nm波長(zhǎng)處逐個(gè)檢測(cè)吸光度(y)值。

1.2.2 野菊莖葉多糖的提取及提取量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.6 g 野菊莖葉粉末于小型索氏提取器的濾紙桶里，水浴加熱乙醚抽提至無色[17]，再換用乙醇抽提至無色。將野菊莖葉粉末取出，晾干后放進(jìn)塑料提取管內(nèi)，加適量水，用微波輔助在不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間、微波功率等條件下提取野菊莖葉中的多糖，抽濾，野菊莖葉濾渣用相同方法再提取1次，將2次提取液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，洗滌，定容，移取2 mL溶液于具塞比色管中，加入3 mL 苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，搖勻，80 ℃水浴保溫20 min，取出冷卻至室溫，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定野菊莖葉多糖的提取量。

1.2.3 野菊莖葉多糖提取的單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化

(1) 料液比：在提取溫度80 ℃，提取時(shí)間10 min，微波功率450 W，料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)的條件下，測(cè)定野菊莖葉多糖的提取量。

(2) 提取溫度：在料液比1∶40 (g/mL)，提取時(shí)間10 min，微波功率450 W，提取溫度分別為50，60，70，80，90，100 ℃的條件下，測(cè)定野菊莖葉多糖的提取量。

(3) 提取時(shí)間：在料液比1∶40 (g/mL)，提取溫度80 ℃，微波功率450 W，提取時(shí)間分別為4，6，8，10，12，14 min 的條件下，測(cè)定野菊莖葉多糖的提取量。

(4) 微波功率：在料液比1∶40 (g/mL)，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間10 min，微波功率分別為300，350，400，450，500，550 W的條件下，測(cè)定野菊莖葉多糖的提取量。

(5) 正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、微波功率為試驗(yàn)因素，以野菊莖葉多糖的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化野菊莖葉多糖的微波輔助法提取工藝條件。

1.2.4 野菊莖葉多糖的提取和純化 稱取100 g野菊莖葉粉末放入常量索氏提取器中依次用乙醚和乙醇抽提至提取液呈無色。取出野菊莖葉粉末，晾干，在最佳提取工藝下提取多糖，抽濾，將粉末用水再提取1次，合并提取液。將提取液減壓濃縮蒸出總體積2/3的水，并加入5倍體積的乙醇，靜置24 h，抽濾，濾餅干燥，得粗多糖。平行提取5次，合并粗多糖，用水-乙醇重結(jié)晶，再經(jīng)Sevag 法用正丁醇和氯仿脫蛋白，濃縮，通過DEAE-纖維素柱(5.0 cm×120.0 cm)依次用水和0.1 mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫分離，流速為2 mL/min，每管10 mL，苯酚-硫酸法檢測(cè)，減壓濃縮收集液。合并氯化鈉溶液洗脫的糖液，乙醇沉淀過夜，抽濾，置于105 ℃ 干燥箱中干燥至恒重，得到野菊莖葉精制多糖。

1.2.5 野菊莖葉多糖的抗氧化活性

(1) 對(duì)·OH清除作用：通過Fenton體系中對(duì)Fe2+/H2O2產(chǎn)生的·OH清除率來確定。稱取2.5 mg 野菊莖葉精制多糖定容于25 mL容量瓶中，得濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，取8支10 mL具塞比色管，其中6支編號(hào)為1～6號(hào)，依次加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL多糖溶液；另2支標(biāo)記為未損傷管和損傷管，不加多糖溶液。分別向8支具塞比色管中加入1 mL鄰二氮菲溶液、1.5 mL PBS 溶液和1 mL 亞硫酸鐵溶液，搖勻，再向1～6號(hào)以及損傷管中移取1 mL 過氧化氫溶液，將8支比色管用水滴加至刻度線，搖勻，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃下保溫2 h，取出冷卻至室溫，在510 nm下測(cè)量吸光度(I)值。同時(shí)，以相同濃度的VC作為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。按式(1)計(jì)算·OH的清除率。

(1)

式中：

A——清除率，%；

In——加多糖溶液或VC溶液的吸光度；

I1——未損傷管溶液的吸光度；

I0——損傷管溶液的吸光度。

(2) 對(duì)DPPH·清除作用：準(zhǔn)確稱取野菊莖葉精制多糖分別置于6個(gè)5 mL的容量瓶中，配成濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL多糖溶液；再取6個(gè)5 mL的容量瓶，稱取VC，配成和多糖溶液濃度相同的VC溶液。分別移取2 mL不同濃度的多糖溶液于6支5 mL具塞比色管中，再分別加入2 mL DPPH溶液，混勻，避光室溫放置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記作A1；用水取代多糖溶液重復(fù)試驗(yàn)，在同樣波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記作A0；以水取代DPPH溶液作為空白，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記作A2。相同濃度的VC作為對(duì)照代替多糖溶液重復(fù)試驗(yàn)。按式(2)計(jì)算DPPH·的清除率。

(2)

式中：

B——清除率，%；

A0——水和DPPH溶液的吸光度；

A1——不同濃度的多糖溶液和DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度；

A2——不同濃度的多糖溶液和水的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)值為縱坐標(biāo)，繪制的糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得回歸方程：y=15.038x+0.065 2，R2=0.998 3，可見在0.02～0.16 mg/mL的范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Glucose stangdard curve

2.2 提取野菊莖葉多糖的單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)野菊莖葉多糖提取的影響 由圖2可知，在1∶10～1∶50 (g/mL)時(shí)隨著料液比值的減小野菊莖葉多糖提取量持續(xù)增大；料液比在1∶50 (g/mL)之后提取量減小，可能是溶劑量增大會(huì)導(dǎo)致微波作用于野菊莖葉組織的能量減小，不利于多糖溶出。料液比在1∶40～1∶50 (g/mL)時(shí)提取量沒有顯著性差異，故選取料液比1∶40 (g/mL)。

2.2.2 提取溫度對(duì)野菊莖葉多糖提取的影響 由圖3可知，在50～80 ℃時(shí)野菊莖葉多糖提取量持續(xù)升高；當(dāng)溫度超過80 ℃后，野菊莖葉多糖提取量逐漸下降，可能是持續(xù)的高溫和微波處理會(huì)使野菊莖葉多糖發(fā)生分解，使提取量減小。因此選擇提取溫度80 ℃。

圖2 料液比對(duì)多糖提取量的影響Figure 2 Effects of solid-liquid ratio on the polysaccharide extraction content

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取量的影響Figure 3 Effects of extraction temperature on the polysaccharide extraction content

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)野菊莖葉多糖提取的影響 由圖4可知，在4～8 min時(shí)野菊莖葉多糖提取量持續(xù)遞增；8 min后開始下降，可能是較長(zhǎng)時(shí)間的微波處理使部分多糖鏈斷裂造成損失，使多糖提取量減小。因此選擇提取時(shí)間8 min。

2.2.4 微波功率對(duì)野菊莖葉多糖提取的影響 由圖5可知，在300～450 W時(shí)野菊莖葉多糖提取量隨著微波功率的增大而增大；微波功率達(dá)到450 W之后，其多糖提取量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，可能是較大的微波功率會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)促使多糖分解。因此選擇微波功率450 W。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化野菊莖葉多糖的提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素取3個(gè)水平(表1)，以野菊莖葉多糖提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來優(yōu)化野菊莖葉多糖的提取工藝，結(jié)果見表2。由表2可知，影響野菊莖葉多糖提取的因素主次為：微波功率>提取溫度>提取時(shí)間>料液比，最佳提取工藝條件為料液比1∶40 (g/mL)、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間10 min、微波功率450 W。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響Figure 4 Effects of extraction time on the polysaccharide extraction content

圖5 微波功率對(duì)多糖提取量的影響Figure 5 Effects of microwave power on the polysaccharide extraction content

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，在最佳提取工藝條件下野菊莖葉多糖提取量高達(dá)6.32%，而且提取過程中溫度不高，料液比適中，能快速進(jìn)行多糖的提取，該工藝條件適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4 野菊莖葉多糖的抗氧化活性

2.4.1 對(duì)·OH的清除作用 由圖6可知，野菊莖葉多糖對(duì)Fe2+/H2O2產(chǎn)生的·OH有清除作用，且隨其多糖濃度的增大對(duì)·OH的清除率不斷提高，二者之間存在著一定的量效關(guān)系。和VC比較，野菊莖葉多糖對(duì)·OH的清除率整體偏低，但也表現(xiàn)出明顯的清除效果，說明其多糖能清除·OH，有抗氧化活性。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor and level graph

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Date and analysis of orthogonaltext

圖6 野菊莖葉多糖對(duì)·OH的清除作用Figure 6 Scavenging activity of polysaccharide from the branches and leaves of Chrysanthemum indicum on ·OH

2.4.2 清除DPPH·的作用 由圖7可知，相同濃度下野菊莖葉多糖和Vc對(duì)DPPH·的清除作用存在差異，野菊莖葉多糖對(duì)DPPH·的清除效果弱于VC，但也反映出對(duì)DPPH· 有明顯的清除作用，且野菊莖葉多糖濃度和對(duì)DPPH·的清除率存在著量效關(guān)系。說明野菊莖葉多糖是一種潛在的抗氧化物質(zhì)。

圖7 野菊莖葉多糖對(duì)DPPH·的清除作用Figure 7 Scavenging activity of polysaccharide from the branches and leaves of Chrysanthemum indicum on DPPH·

3 結(jié)論

本研究借助微波輔助法提取野菊莖葉中的多糖，以多糖提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素及正交試驗(yàn)確定野菊莖葉多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶40 (g/mL)、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間10 min、微波功率450 W，在該條件下野菊莖葉多糖的提取量高達(dá)6.32%。借助微波輔助法能快速提取野菊莖葉中的多糖，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)，同時(shí)，也為分步提取天然產(chǎn)物中的活性成分提供了思路。本試驗(yàn)證實(shí)野菊莖葉多糖具有抗氧化活性，是一種潛在的抗氧化物質(zhì)。后續(xù)將對(duì)野菊莖葉多糖的其他生物活性以及構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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