高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜肉組織中四環(huán)素及3種β-受體激動(dòng)劑的研究

郭艷瓊 ，張曉光 ，鄔 杰 ，鄔 陽 ，翟泰宇 ，王建軍

（1.包頭市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

β-受體激動(dòng)劑（β-agonists）是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，俗稱瘦肉精，可分為苯酚型（包括沙丁胺醇）、間苯二酚型（包括非諾特羅、特布他林及萊克多巴胺）、苯胺型（包括西馬特羅及鹽酸克倫特羅）［1］。由于β-受體激動(dòng)劑具有促進(jìn)動(dòng)物肌肉組織增長、減少脂肪沉積、改善肉質(zhì)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、營養(yǎng)再分配［2］、提高瘦肉率等作用，故被作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中［3］。人體如果攝入含有高濃度瘦肉精的動(dòng)物組織，將會(huì)出現(xiàn)心動(dòng)過速、肌肉震顫、惡心、眩暈、心悸等中毒癥狀，長期食用會(huì)對人體健康產(chǎn)生極大的危害，甚至危及生命［4］。四環(huán)素具有廣譜抗生活性，能特異性地與細(xì)菌核糖體30 S亞基的A位置結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA在該位上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽鏈的增長和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成［5］，對革蘭陽性菌及陰性菌、原蟲、支原體、螺旋體均有作用。但長期濫用四環(huán)素類藥物，會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物性產(chǎn)品內(nèi)大量殘留，不但危害人體的健康，造成腎及肝的損害還極易誘導(dǎo)各種致病菌產(chǎn)生抗藥性，不利于對人類及畜禽類各種疾病的治療［6］。由于實(shí)際工作中，四環(huán)素和β-受體激動(dòng)劑常配合使用，故需要同時(shí)檢測這4種物質(zhì)。但同時(shí)檢測3種瘦肉精及四環(huán)素的方法鮮有報(bào)道。該研究運(yùn)用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，同時(shí)測定畜禽肉中的四環(huán)素及β-受體激動(dòng)劑殘留，旨在為大量、快速檢測畜肉中這4類物質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

Sigma 3-18K冷凍離心機(jī)、Agilent 1260-6420高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）、北京優(yōu)晟UGC-24C氮吹儀。

1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品

鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇及四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于99%，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境科研監(jiān)測站，濃度為1 000 μg/mL；異丙醇 （色譜純，F(xiàn)isher Scientific），甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific），甲酸（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；所用水均為屈臣氏蒸餾水。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：液相色譜柱為Agilent Eclipse Plus C183.5 μm 2.1 mm×100 mm。流動(dòng)相為 A：0.1%的甲酸水溶液，B：甲醇。流動(dòng)相流速為0.5 mL/min，流動(dòng)相的梯度洗脫條件見表1。柱溫箱溫度為45 ℃，進(jìn)樣量為 15 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件：質(zhì)譜離子源為電噴霧式離子源（ESI），掃描方式是正離子模式，檢測方法為多反應(yīng)檢測MRM。干燥氣溫度設(shè)為300℃，干燥氣流量為13 L/min。多反應(yīng)檢測離子對離子情況見表2。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：根據(jù)單一標(biāo)準(zhǔn)品在高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜下的峰面積大小及在畜禽肉中殘留量不同，每種標(biāo)準(zhǔn)品配制的曲線濃度也有所不同。4種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為：四環(huán)素配制成濃度為 0.009 0、0.007 2、0.004 2、0.002 7、0.000 9 μg/mL；萊克多巴胺及沙丁胺醇配制濃度為 0.56、0.32、0.16、0.08、0.01 μg/mL；鹽酸克倫特羅 配制濃 度為 0.50、0.40、0.30、0.05、0.01 μg/mL。

1.3.4 樣品處理：稱取已絞碎的肉樣2.00g于50mL離心管中，分別加入pH值為5.2的乙酸銨緩沖溶液 （0.2 mol/L）7 mL，β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL，渦旋混勻，搖床避光水浴振蕩16 h，水溫保持在37℃。

將酶解完全的樣品放于室溫下并冷卻至室溫，高速離心，離心條件為 10 min×10 000 r/min，移出上清液置于另一個(gè)50 mL的離心管中，將所得上清液以1.5 mL/min的速度通過已用3 mL甲醇及3 mL水活化后的PEP固相萃取小柱，然后用3 mL 10%的甲醇水溶液淋洗，減壓抽至干燥。最后用5 mL 5%的氨水甲醇溶液洗脫，并收集洗脫液，氮?dú)庀麓蹈?，?.1%甲酸水+甲醇溶液按40%+60%的比例定容至1.0 mL，供高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

將配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照濃度由低到高依次上機(jī)檢測，以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），標(biāo)準(zhǔn)樣品定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可以看出，3種β-受體激動(dòng)劑萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅及四環(huán)素在其各自的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好線性關(guān)系，且線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。

2.2 質(zhì)譜條件選擇

利用電噴霧離子源，首先對單一標(biāo)液進(jìn)行全質(zhì)量數(shù)掃描（MS1 Scan），準(zhǔn)確找出（質(zhì)量數(shù)+1）+離子峰，以其為母離子進(jìn)行電子轟擊，并對碰撞得到的產(chǎn)物離子進(jìn)行全掃描（Production），得到碰撞產(chǎn)生的子離子，找到2個(gè)峰面積較高的產(chǎn)物離子與母離子組成監(jiān)測離子對并進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），該監(jiān)測離子對為該化合物的質(zhì)譜檢測條件。附加毛細(xì)管電壓對母離子的豐度影響較大，由于電場力和重力的作用，所加電壓較小時(shí)，重力作用大于電場力作用，會(huì)導(dǎo)致母離子無法順利通過毛細(xì)管。所加電壓過大時(shí)，電場力作用大于重力作用，會(huì)使得母離子在經(jīng)過時(shí)速度變慢，與四級桿碰撞加強(qiáng)，造成信號減弱。碰撞能量對產(chǎn)物離子的響應(yīng)有較大影響，當(dāng)碰撞能量太大時(shí)，母離子會(huì)碎裂成為質(zhì)譜無法檢測到的較小碎片離子；當(dāng)碰撞能量較小會(huì)造成母離子不能被打碎完全，故碰撞能量及毛細(xì)管電壓對化合物的在質(zhì)譜中的響應(yīng)有很大影響［7］。分別對毛細(xì)管電壓從75～140 V，以5 V為梯度進(jìn)行優(yōu)化；對碰撞能量從5～50 eV，以5 eV為梯度進(jìn)行優(yōu)化，分別得到4種化合物的最優(yōu)毛細(xì)管電壓及碰撞能量。質(zhì)譜掃描圖見圖2。

表2 化合物MRM參數(shù)

圖1 4種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 4種化合物的質(zhì)譜掃描圖

2.3 方法定量限及檢出限

以信噪比等于3時(shí)的標(biāo)液濃度為檢出限，由此可以推算出萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇的檢出限（LOD）為 0.25 μg/kg，四環(huán)素的檢出限為2.5 μg/kg。以信噪比為10時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為定量限，則萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅的定量限為0.5 μg/kg，四環(huán)素的定量限為5 μg/kg。

2.4 方法回收率及精密度

以空白為本底添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)，4種化合物的平均回收率為90%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10%～15%。

3 結(jié)論

禽畜肉中獸藥殘留嚴(yán)重影響人們的健康，獸藥殘留的檢測已引起了相關(guān)部門的高度重視。四環(huán)素又經(jīng)常與萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅等β-受體激動(dòng)劑配合使用，其殘留問題比較普遍［8］。為縮短試驗(yàn)時(shí)間，節(jié)約試驗(yàn)成本，該試驗(yàn)優(yōu)化了3種β-受體激動(dòng)劑萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅及四環(huán)素的質(zhì)譜條件，并建立了同時(shí)測定畜肉中這4種化合物的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。四環(huán)素及3種β-受體激動(dòng)劑以0.1%甲酸水+甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行檢測分析，靈敏度高且分析時(shí)間較短，重現(xiàn)性和回收率指標(biāo)等均可以滿足定量檢測要求。該方法操作簡便、重復(fù)性好，靈敏度及精密度均能滿足要求，適用于畜肉中沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅及四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的同時(shí)測定，尤其適合大批量樣品的快速準(zhǔn)確的定性定量分析，可較好地運(yùn)用于實(shí)際檢測工作中。

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