銅仁市豬瘟病毒抗體的免疫水平監(jiān)測(cè)

張俊波，印雙紅，陸安法，白 明，任品開(kāi)，吳橙耀，李利霞

（ 1．銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2．銅仁學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 銅仁 554300；3．銅仁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 銅仁 554300）

0.引言

豬瘟又稱爛腸瘟，一種由豬瘟病毒引起豬的強(qiáng)烈接觸性、致死性傳染病。由于豬瘟病毒的入侵導(dǎo)致豬的小血管變性，而造成豬的內(nèi)臟器官出血、壞死和梗塞[1]。該病因具有強(qiáng)烈的致死性和傳染性、發(fā)病無(wú)季節(jié)性，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已被列入世界衛(wèi)生組織（OIE）疫病名錄，并聲明該病為必須申報(bào)的傳染病[2]。

豬瘟病毒在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，我國(guó)是世界上養(yǎng)豬業(yè)較大的國(guó)家，所以也是受豬瘟影響較為嚴(yán)重的國(guó)家，每年因豬瘟致死的豬占總病豬的30%，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)100個(gè)億[3]。參照相關(guān)文獻(xiàn)，關(guān)于豬瘟的記載最早出現(xiàn)于1833年美國(guó)的俄亥俄州，隨后在胸利亞、日本等國(guó)家發(fā)現(xiàn)并研究，但是豬瘟的控制都沒(méi)有取得很好的成績(jī)。直到1933年，丹麥?zhǔn)状涡剂藷o(wú)豬瘟疫情，隨后瑞典、挪威、愛(ài)爾蘭等13個(gè)國(guó)家宣布無(wú)豬瘟疫情。近年來(lái)，一些宣布已消滅豬瘟的國(guó)家又見(jiàn)豬瘟復(fù)發(fā)的報(bào)道[4-5]。豬瘟在我國(guó)的相關(guān)研究和報(bào)道最早于1925年，東南大學(xué)研究了CSF免疫血清[6-7]。1956年研制出了一種有效防控豬瘟疫情，對(duì)豬無(wú)毒但具有豬瘟免疫原形的活疫苗豬瘟兔化弱毒疫苗。使經(jīng)免疫的豬具有持久免疫能力，也減少了被其他病毒感染的概率。它彌補(bǔ)了滅活疫苗免疫期短，免疫能力低等缺陷。因此，該疫苗被認(rèn)為是最具有安全性和免疫原性最好的疫苗[8]。至今該疫苗仍被許多國(guó)家應(yīng)用于豬瘟病毒的防控。

1965年，我國(guó)提出了徹底消除豬瘟的計(jì)劃，經(jīng)過(guò)全國(guó)許多專家學(xué)者的不懈努力，我國(guó)在豬瘟的防控方面取得了非常大的成績(jī)。但是目前豬瘟仍然廣泛流行于我國(guó)大部分地區(qū)，要徹底消滅豬瘟仍然很遙遠(yuǎn)[9]。銅仁市是一個(gè)少數(shù)民族地區(qū)，以豬肉為主要肉食，由于地方經(jīng)濟(jì)比較落后，豬場(chǎng)規(guī)模不大，一般為一百多頭豬的小規(guī)模豬場(chǎng)，而銅仁市各個(gè)縣城和市區(qū)豬肉市場(chǎng)主要由這些豬場(chǎng)維持，所以這些豬場(chǎng)的豬是否健康直接影響每個(gè)縣城和市區(qū)人民的健康。關(guān)于銅仁市豬瘟免疫方面的研究較少，除了2011年吳高奇等對(duì)銅仁市特種野豬規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)豬瘟免疫抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)外，沒(méi)有其他的相關(guān)資料，而且該文獻(xiàn)顯示，銅仁地區(qū)特種豬免疫水平比較低，為了減少豬瘟給銅仁市養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的損失，養(yǎng)豬業(yè)遵循“預(yù)防為主，防重于治”的有效方針，所以全面了解銅仁市豬市場(chǎng)豬瘟免疫水平顯得至關(guān)重要。結(jié)合銅仁市各地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)規(guī)模特點(diǎn)，于2015年5、11月對(duì)銅仁市8個(gè)縣、兩區(qū)的各鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）隨機(jī)抽取23個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行春、秋兩次豬瘟血清抗體水平定點(diǎn)檢測(cè)工作，為銅仁地區(qū)豬瘟的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1．材料與方法

1．1．樣品來(lái)源

隨機(jī)抽取的銅仁市8各縣兩區(qū)（碧江區(qū)（3個(gè)）、萬(wàn)山區(qū)（1個(gè)）、思南縣（3個(gè)）、松桃縣（3個(gè)）、德江縣（2個(gè)）、印江縣（2個(gè)）、石阡縣（3個(gè)）、沿河縣（2個(gè)）、江口縣（1個(gè)）、玉屏縣（3個(gè)）)共23個(gè)100來(lái)頭規(guī)模大小的豬場(chǎng)定點(diǎn)場(chǎng)，每個(gè)豬場(chǎng)隨機(jī)采取20份豬血清。

1．2．材料與儀器

1．2．1．試劑與器材

豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（由武漢科前生物制品有限責(zé)任公司提供，批號(hào)，20121012，20130110，20130902）。

1．2．2．主要儀器

振動(dòng)器；自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó) BioTek儀器有限公司）；單道微量移液槍（eppendorf公司）；8道微量移液槍（thrmo公司）；恒溫培養(yǎng)箱（北京市光明醫(yī)療儀器廠）。

1．3．方法

1．3．1．樣品采集

血清共分為2次均等采集，分別是2015年5月、2015年11月。對(duì)選定的豬進(jìn)行前腔靜脈采血，方法分為三個(gè)步驟，如下：

（1）豬的保定：對(duì)中大豬的保定：用保定繩套住豬的上腭，將繩子斜向上，至豬的頸部皮膚充分崩緊，左右顯出兩個(gè)較深的窩。對(duì)仔豬的保定：直接仰臥。

（2）進(jìn)針采血：將豬保定好中大豬后，選取左右兩個(gè)窩中較深的一個(gè)作為進(jìn)針點(diǎn)，選定進(jìn)針點(diǎn)，用碘酊消毒，手持一次性采血盛血器，從對(duì)側(cè)肩胛骨呈45°方向刺入，抽取5 mL血液。

（3）血清制備：抽取血液完后立即置于 30℃左右環(huán)境，傾斜靜置半小時(shí)左右，每份吸取血清1 mL于1.5 mL EP管，做好標(biāo)記，-20℃保存。

1．3．2．間接ELISA原理

在試驗(yàn)中加入稀釋的對(duì)照血清和待測(cè)血清，經(jīng)溫育后，若樣品中含有豬瘟病毒的特異性抗體，則與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分，再加入羊抗豬酶標(biāo)二抗，與包被板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合，再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，加入底物與抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性避光反應(yīng)10 min，再加入終止液，運(yùn)用酶標(biāo)儀測(cè)出OD值，即可得到該豬血清的病毒效價(jià)。具體操作如下：

檢測(cè)前的準(zhǔn)備2 h：

（1）解凍，取出冷凍的待測(cè)血清置于室溫（20～25℃），充分解凍后，震蕩混勻以備用。

（2）將冷藏保存的試劑盒放置室溫，使其恢復(fù)至室溫（20～25℃），備用。

（3）根據(jù)實(shí)際需要量將洗滌液稀釋20倍盛于燒杯中，備用。

檢測(cè)操作：

（4）將待檢血清稀釋20倍。用8道微量移液槍取樣品稀釋液195 μL于稀釋孔中，再逐孔加入待檢血清5 μL，記錄對(duì)應(yīng)的編號(hào)，置于震蕩器上混勻。

（5）吸取 100 μL稀釋好的待檢血清于抗原包被孔，貼好封口膜，于37℃恒溫培養(yǎng)箱溫育30 min。

（6）溫育結(jié)束后，倒掉抗原包被孔中的液體，在濾紙上拍干。每孔加入200μL稀釋好的洗滌液，在室溫下放置5 min，倒掉洗滌液，拍干。如此重復(fù)5次。

（7）洗滌結(jié)束后，每個(gè)抗原包被孔中加入100 μL羊抗豬酶標(biāo)二抗，貼上封口膜，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，溫育30 min。

（8）按步驟（6）的操作方法再次進(jìn)行洗滌。

（9）洗滌完后，充分拍干包被孔中的液體，先后加入底物A和底物B各50μL，貼上封口膜，避光顯色10min。

（10）顯色后加入終止液5 μL，10 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm波長(zhǎng)的吸光度值。

1．3．3．結(jié)果轉(zhuǎn)換

嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)上的步驟測(cè)定其樣品OD值。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，按表1進(jìn)行OD值與抗體效價(jià)的轉(zhuǎn)換。

表1 豬瘟抗體OD值與豬瘟間接血凝試驗(yàn)（HIA）效價(jià)的轉(zhuǎn)換Tab.1 Conversion of OD value of swine fever antibody ELISA and the titer of swine fever Indirect Hemagglutination Test(HIA)

2．結(jié)果與分析

2．1．銅仁市豬瘟血清采樣數(shù)量

本次實(shí)驗(yàn)包括春、秋兩次豬瘟血清監(jiān)測(cè)，共采集豬血清920份，檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性血清有831份。通過(guò)對(duì)銅仁市八個(gè)縣、兩區(qū)定點(diǎn)豬場(chǎng)的豬瘟血清ELISA抗體檢測(cè)（表2）。

表2 不同地區(qū)豬瘟抗體采樣數(shù)量Tab.2 Swine fever antibody samples of different regions

2．2．銅仁市豬瘟抗體總陽(yáng)性率結(jié)果分析

該市春季豬瘟血清檢測(cè)的460份樣品中，陽(yáng)性血清40份，占總陽(yáng)性率為88.91%，平均陽(yáng)性率為88.33%；秋季檢測(cè)的460份血清中陽(yáng)性血清422份，總陽(yáng)性率為91.73%，平均血清陽(yáng)性率89.16%。碧江區(qū)、萬(wàn)山區(qū)、思南縣、松桃縣、德江縣、印江縣、石阡縣、沿河縣、江口縣、玉屏縣的春季陽(yáng)性率依次為：90.00%、80.00%、100%、76.67%、72.50%、100%、100%、82.50%、95.00%、86.67%；秋季陽(yáng)性率依次為：93.33%、70.00%、95.00%、83.33%、80.00%、95.00%、100.00%、100.00%、75.00%、100.00%（表3）。

表3 不同地區(qū)豬瘟陽(yáng)性抗體統(tǒng)計(jì)Tab.3 Swine fever antibodies of different areas

春季抗體效價(jià)為1:32以下的血清占總樣本的11.09%（秋季為8.26%），春季抗體效價(jià)為1:32的血清占總樣本的25.00%（秋季為23.79%），春季抗體效價(jià)為1:64的血清占總樣本的28.70%（秋季為31.52%），抗體效價(jià)為1:128的血清占總樣本的23.26%（秋季為23.79%），抗體效價(jià)為1:256的血清占總樣本的11.96%（秋季為13.26%）（表4）。從春秋季節(jié)豬瘟抗體水平結(jié)果可以看出，秋季的豬瘟抗體的免疫水平較高。

表4 不同抗體滴度的樣本數(shù)及比例統(tǒng)計(jì)表Tab.4 The number and proportion of samples of different antibody titers

2．3．不同地區(qū)豬瘟抗體水平結(jié)果分析

以抗體效價(jià)≥1:32為陽(yáng)性血清，陽(yáng)性抗體所占比例較高的為石阡縣，春秋兩季的陽(yáng)性血清比例均為100%，其陽(yáng)性率最高。萬(wàn)山區(qū)春秋兩季的陽(yáng)性率都小于80%，是陽(yáng)性率最低的地區(qū)。血清陽(yáng)性率達(dá)100%，春季包括思南、印江，秋季包括石阡縣、沿河縣和玉屏縣。陽(yáng)性率達(dá)90%以上的，春季包括碧江區(qū)（90.00%）、江口縣（95.00%)；秋季包括碧江區(qū)（93.33%）、思南縣（95.00%）、印江縣（95.00%），秋季血清陽(yáng)性率較低有松桃（76.67%）和德江（72.50%）（表5）。

表5 不同地區(qū)春秋季抗體水平樣品數(shù)統(tǒng)計(jì)表Tab.5 The number of samples of antibody level in different regions in Spring and Autumn

春、秋季血清陽(yáng)性率增大較多的地區(qū)，主要表現(xiàn)為抗體效價(jià)≥1:32的比例減少，抗體效價(jià)為≥1:64、≥1:128、≥1:256的比例增大；血清陽(yáng)性率增加較少的地區(qū)抗體效價(jià)≥1:32的比例增大，抗體效價(jià)≥1:64以上的比例變化很?。谎尻?yáng)性率減少的地區(qū)中抗體效價(jià)為≥1:256比例減小。從各個(gè)區(qū)縣總體來(lái)看，豬瘟抗體秋季陽(yáng)性率和陽(yáng)性水平均高于春季（表6和表 7）。

表6 春季不同地區(qū)豬瘟抗體抗體水平樣品比例Tab.6 Sample ratio of classical swine fever antibody antibody level in different regions in Spring

表7 秋季不同地區(qū)豬瘟抗體水平樣品比例Tab.7 Sample ratio of classical swine fever antibody level in different regions in Autumn

2．4．不同類型豬豬瘟抗體水平結(jié)果分析

對(duì)不同類型豬瘟抗體陽(yáng)性率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，公豬血清抗陽(yáng)性率93.10%，陽(yáng)性率最高；其次是保育豬，血清陽(yáng)性率為91.78%，然后依次是：母豬為90.28%，育肥豬為89.30%，哺乳仔豬為89.14%（表8）。哺乳仔豬血清陽(yáng)性率最低。從整體水平上分析，各類豬血清陽(yáng)性率存在差異。

表8 不同類型豬豬瘟陽(yáng)性率Tab.8 Swine fever positive rates of different types of pigs

3．討論

根據(jù)《免疫計(jì)劃》中存欄豬豬瘟抗體的合格率≥70%為標(biāo)準(zhǔn)，銅仁各地區(qū)檢測(cè)中萬(wàn)山區(qū)（秋70.00%）陽(yáng)性率最低，已達(dá)到《免疫計(jì)劃》的標(biāo)準(zhǔn)，銅仁市豬瘟抗體水平保護(hù)力較高。鄒正舉[10]采用豬瘟正向間接血凝實(shí)驗(yàn)赤水市豬瘟血清進(jìn)行免疫抗體水平監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，赤水市豬瘟抗體合格率為83.19%，諸慶言等[11]在甕安縣豬瘟抗體檢測(cè)情況分析與對(duì)策中，對(duì)36各規(guī)模豬場(chǎng)和256戶養(yǎng)殖戶豬瘟血清檢測(cè)，抗體效價(jià)≥1:32的血清占總樣本的91.22%。簡(jiǎn)秀利[12]在貴州規(guī)模豬場(chǎng)的三種疫病調(diào)查與分析中，對(duì)2011年到2013年全省豬瘟抗體進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示平均抗體水平為73.60%，其中2011最低，為51.00%。馬曉燕等[13]對(duì)新疆地區(qū)進(jìn)行抗體水平監(jiān)測(cè)，新疆地區(qū)的豬瘟抗體合格率為71.30%。程漢等[14]對(duì)江蘇泰州地區(qū)的豬瘟抗體水平檢測(cè)顯示，江蘇泰州地區(qū)豬瘟病毒陽(yáng)性率為79.3%。劉建營(yíng)等[15]對(duì)廣東地區(qū)年豬瘟抗體水平檢測(cè)，結(jié)果顯示，廣東地區(qū)的豬瘟抗體陽(yáng)性率占76.50%。以上相關(guān)文獻(xiàn)顯示，豬瘟抗體水平在省內(nèi)外一些地區(qū)比較低。

從總陽(yáng)性率水平分析，銅仁市免疫水平較高，保護(hù)力較強(qiáng)。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，豬瘟抗體效價(jià)在≥1:32能抵抗強(qiáng)病毒感染。但對(duì)于豬瘟病毒這種強(qiáng)烈致死性和高度傳染性病毒，只要豬瘟病毒存在于豬場(chǎng)，就是非常危險(xiǎn)的。只要存在，該病毒就可能在抗體水平較低或沒(méi)有達(dá)到陽(yáng)性水平的豬之間傳播，抗體水平較低的豬對(duì)豬瘟病毒有抵抗能力，但抵抗能力不強(qiáng)，使之成為帶病豬，表現(xiàn)為免疫耐受。帶病豬也可能通過(guò)飲食、大小便直接將病毒傳遞給共同食宿的低于陽(yáng)性水平的豬，使免疫抗體不合格的豬感染豬瘟。為了減少種種導(dǎo)致豬感染的可能，力求每個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟抗體陽(yáng)性率達(dá)100%。

造成部分豬場(chǎng)豬瘟免疫效果不佳的原因可能是：在標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序生產(chǎn)管理模式下，銅仁市各地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)還存在管理不規(guī)范、免疫劑量不足、疫苗質(zhì)量不高、防疫意識(shí)不強(qiáng)、操作技術(shù)不到位等。簡(jiǎn)秀利[12]對(duì)貴州三種疫病的研究，許追[16]對(duì)四個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng) CSFV、PRRSV和PCV-2混合感染情況的調(diào)查表明，豬瘟常常與豬圓環(huán)病、豬藍(lán)耳病等病癥混合感染，即混合感染等因素，使場(chǎng)內(nèi)部分豬免疫不合格，個(gè)別地區(qū)豬場(chǎng)不合格豬占較大的比例。針對(duì)現(xiàn)有的這些問(wèn)題，各地區(qū)畜牧局應(yīng)加大對(duì)各地豬場(chǎng)豬瘟及其他疫病的監(jiān)測(cè)，對(duì)飼養(yǎng)管理員進(jìn)行免疫相關(guān)知識(shí)的培訓(xùn)普及，聘請(qǐng)專業(yè)人員進(jìn)行免疫操作的指導(dǎo)，加大對(duì)混合感染方面的研究，提出對(duì)本地區(qū)特定的不同日齡豬免疫劑量防控措施，使各地區(qū)豬場(chǎng)都有屬于自己科學(xué)免疫療程，使銅仁市豬瘟抗體水平提高并保持在更高的水平。

4．結(jié)論

綜上所述，目前銅仁市豬瘟抗體水平較高，保護(hù)力較強(qiáng)，但是免疫效果還沒(méi)有達(dá)到預(yù)計(jì)的水平，該血清學(xué)調(diào)查為銅仁市豬瘟的防控奠定了基礎(chǔ)。

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