鐵皮石斛花色苷抑菌活性研究

摘 要：用溶劑法提取鐵皮石斛花色苷并研究其抑菌作用。抑菌實驗表明：鐵皮石斛花色苷對枯草芽孢桿菌抑制作用較強，金黃色葡萄球菌次之，對大腸桿菌的抑制作用最弱，最低抑菌濃度實驗表明鐵皮石斛花色苷對三種常見細菌的最低抑菌濃度分別為1.138 mg/L、0.284mg/L、0.569mg/L，并且隨著花色苷溶液濃度的增加，抑菌效果越明顯。而對黑曲霉和白色念珠菌沒有抑制作用。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；花色苷；抑菌

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）屬蘭科石斛屬植物，俗稱鐵皮楓斗，被國家列為重點保護的瀕臨危藥用植物[1]。近幾年，對鐵皮石斛的研究除了進行組織培養(yǎng)外，更多的是集中在化學物質(zhì)的測定[2]、種類鑒定[3]、共生真菌[4]及藥理作用[5]的臨床試驗等方面。本試驗主要以龍陵鐵皮石斛紫莖為試材，著眼于紫莖的花色苷提取、鑒定和對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉等的抑菌效果。

1 材料

1.1 材料、試劑與儀器

選用新鮮、無病蟲害、無霉爛的鐵皮石斛莖作試材，采購自龍陵縣鐵皮石斛人工種植基地，除葉后于-20℃ 冰箱保存?zhèn)溆?/p>

試劑：甲醇、鹽酸、無水乙醇、蛋白胨、酵母膏、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、鹽酸均為均為國產(chǎn)分析純。

供試菌種：大腸桿菌Escherichia coli標準菌株ATCC25922；金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus標準菌株ATCC259226538；枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis標準菌株ATCC6633，白色念珠菌 Monilia albican ATCC10231，黑曲霉 Aspergillus niger ATCC16404均購自廣東微生物菌種保藏中心。

主要儀器與設(shè)備：CP系列電子天平、冰箱、UV5000紫外可見分光光度計、電熱恒溫水槽、SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵等。

1.2 試驗方法

1.2.1溶劑法提取鐵皮石斛花色苷

將鐵皮石斛從-20℃冰箱取出，取葉鞘和有色素石斛莖表皮剪成長3-5 mm，與剛配制的1%鹽酸甲醇溶液按料液比為1：20的比例混合，放在40℃電熱恒溫水槽溶解兩個半小時后過濾，濾渣中再倒入同比例的1%鹽酸甲醇溶液混合，按同樣的方法再溶解一次，過濾后與第一次的濾液充分混勻，將混勻的濾液倒入棕色瓶于4℃下保存以待備用。

用pH示差法測定[8]，取濃縮后的鐵皮石斛花色苷溶液5mL，分別用pH1.0的氯化鉀緩沖液和pH4.5的乙酸鈉緩沖液定容至25 mL，室溫下平衡90 min。

按照下式計算吸光度值：A=（A530-A700）pH1.0-（A530-A700）pH4.5；

原樣液中花色苷濃度為：C（mg/L）=（A×MW×DF×1000）/（ε×1）

式中：MW—樣品中主要花色苷的分子量，MW=449.2；DF—稀釋因子，此處為5；ε—樣品中主要花色苷的摩爾吸收率，ε=26，900。

1.2.2 花色苷抑菌試驗相關(guān)試材及溶劑的制備

（1）溶液及培養(yǎng)基的配置

稱取0.9 g氯化鈉于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水溶解，121℃，濕熱滅菌30 min。

100 mL LB液體培養(yǎng)基配置，1000 mL LB固體培養(yǎng)基配置，取20套已滅菌的培養(yǎng)皿，在超凈工作臺上用已滅菌的培養(yǎng)基到入培養(yǎng)皿中，冷卻，備用。

（2）菌種的活化及菌懸液的制備

將購買的五種供試菌在37℃/24 h條件下，活化兩次后制備菌懸液，于37℃ 150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。用比濁法[10]測定菌懸液的光密度值來推測其濃度。

（3）不同濃度花色苷溶液的制備

二次稀釋法[34]分別配制不同濃度的花色苷溶液。設(shè)11個濃度梯度。對照組用無菌水處理。用已滅菌的直徑為5 mm的圓形濾紙片放入不同濃度的花色苷溶液和無菌水中，每瓶溶液中放四片，浸泡30 min，備用。

1.2.3花色苷抑菌活性試驗

取0.1 mL菌懸液至已經(jīng)冷卻的固體培養(yǎng)基中，用無菌涂布器均勻涂布。待晾干后用無菌鑷子夾取浸泡過的含有不同濃度的濾紙片，等距離放置于培養(yǎng)基中。37℃/24 h下培養(yǎng)，用直尺量取各抑菌圈的直徑（mm），重復3次。并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 比較鐵皮石斛不同濃度花色苷抑制三種細菌的抑菌圈大小

由表1可知鐵皮石斛花色苷對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金紅色葡萄球菌的抑制效果，花色苷對枯草芽孢桿菌的抑制作用較為明顯，抑菌作用大小為枯草芽孢桿菌>金紅色葡萄球菌>大腸桿菌。

3 結(jié)論

用溶劑法提取鐵皮石斛花色苷，pH示差法測得花色苷濃度為145.698mg/L。將花色苷溶液二倍稀釋，作為抑菌溶液，來觀察不同濃度的花色苷對三種常見細菌的抑制作用。抑制作用大小為枯草芽孢桿菌>金紅色葡萄球菌>大腸桿菌。對大腸桿菌的最低抑制濃度為0.569mg/L，鐵皮石斛花色苷溶液對枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度為1.138 mg/L，對金紅色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.284mg/L。對兩種真菌：白色念珠菌和黑曲霉均無抑制作用。

基金項目：保山學院科研項目（2015BZ006）

參考文獻

[1]呂圭源，顏美秋，陳素紅.鐵皮石斛功效相關(guān)藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2013，38（4）：489-493.

[2]諸燕，張愛蓮，何伯偉，等.鐵皮石斛總生物堿含量變異規(guī)律[J].中國中藥雜志，2010，35（18）：2388-2391.

[3]劉文杰，孫志蓉，杜遠，等.不同產(chǎn)地鐵皮石斛主要化學成分及指紋圖譜研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2013，36（2）：117-120.

[4]嚴亮，楊瑞娟，王橋美.云南鐵皮石斛內(nèi)生菌的分離與鑒定[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2015（5）：760-765.

[5]覃輝艷，梁慧莉，姚思宇，等.鐵皮石斛顆粒增強免疫力作用的實驗研究[J].應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學，2016（1）：81-83.

作者簡介：

楊曉娜（1984—），女（回），臨滄鳳慶，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)

（作者單位：保山學院，資源環(huán)境學院）