去甲斑蝥素調(diào)控YAP增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

郭紀(jì)偉，武 艷，金 丹，陳微微，代娟娟

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室、2.疼痛科， 山東 濱州 256603)

YAP信號(hào)通路是近年來(lái)揭示出的控制細(xì)胞增殖與凋亡的內(nèi)在關(guān)鍵調(diào)控通路[1-2]。YAP信號(hào)通路功能異常后將促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡等過(guò)程，導(dǎo)致組織呈腫瘤狀過(guò)度生長(zhǎng)[3-4]。 YAP信號(hào)通路尤其是YAP分子與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系報(bào)道較多，但其與順鉑敏感性的關(guān)系迄今未見詳細(xì)研究和報(bào)道[5-6]。

順鉑(cisplatin，DDP)是治療肺癌的一種常用化療藥物。它是細(xì)胞周期非特異性的毒性抗腫瘤藥物，同時(shí)也是第一種用于臨床的金屬類化療藥物[7-8]。但是病人使用高劑量的順鉑后極易產(chǎn)生耐藥，最后導(dǎo)致較高的死亡率[9]。如何降低順鉑耐藥，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性已經(jīng)成為肺癌臨床治療急需解決的問題[10]。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是由斑蝥素反應(yīng)合成，與斑蝥素構(gòu)型相同，去掉了1，2位甲基。NCTD毒副作用小，對(duì)泌尿系統(tǒng)基本無(wú)刺激性[11-12]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，NCTD對(duì)常見腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，重要的是其不會(huì)產(chǎn)生抗藥性[13]，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制目前尚未十分明確[14]。本文以A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，闡明YAP在肺癌細(xì)胞增殖中的分子機(jī)制，并研究聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP對(duì)A549細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、順鉑的敏感性及對(duì)YAP分子的影響。最終為肺癌臨床治療中聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP提供新的治療思路并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞HBEC、A549、H1299、Calu6、H520購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所(ATCC)。細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%(V/V)青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2試劑RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，兔抗人caspase-3、Annexin V、YAP、CTGF和Cyr61單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，MTT和CCK-8試劑購(gòu)于碧云天公司，免疫熒光二抗488和547購(gòu)于Thermo公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo公司，順鉑和去甲斑蝥素粉末購(gòu)自山東齊魯制藥。

1.3儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；激光共聚焦顯微鏡，美國(guó)Leica公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司。

2 方法

2.1CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×103個(gè)/100 μL接種于96 孔板。細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的NCTD (0、2、4、8、10、12 mg·L-1)和DDP(0、1、2、4、6、8 mg·L-1)，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別作用60 h，每孔再加入CCK-8 10 μL，37℃震蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)處吸收度(OD)值，并計(jì)算A549細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(OD處理組-OD空白組) /(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，加入4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同時(shí)加入以上兩個(gè)濃度的NCTD和DDP，并設(shè)調(diào)零孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別作用24、48、60、72、96 h，然后，每孔加入MTT (5 g·L-1) 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔再加入DMSO 100 μL，37℃震蕩10 min，直至紫褐色沉淀完全溶解。采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在570 nm波長(zhǎng)處吸收度(OD)值，并繪制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.3RT-PCR4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同時(shí)加入以上兩個(gè)濃度的NCTD和DDP處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞。按試劑盒說(shuō)明書提取RNA，然后取10 μL 總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照 TransGen EasyTaq PCR SuperMix 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，以GAPDH作為內(nèi)參校正，以3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR 引物序列：YAP 上游引物：5′-GGACCCCAGACGACTTCCTCAACAG-3′，YAP 下游引物：5′-CCTTCCAGTGTGCCAAGGTCCACAT-3′；CTGF 上游引物：5′-AATGCTGCGAGGAGTGGGT-3′，CTGF 下游引物：5′-CGGCTCTAATCATAGTTGGGTCT-3′；Cyr61 上游引物：5′-GAGTGGGTCTGTGACGAGGAT-3′，Cyr61 下游引物：5′-GGTTGTATAGGATGCGAGGCT-3′;GAPDH 上游引物：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′，GAPDH 下游引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。

2.4Westernblot檢測(cè)收集處理的細(xì)胞，NP40裂解液裂解細(xì)胞后，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，取30 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育caspase-3、Annexin V、YAP、CTGF和Cyr61的單克隆一抗后，孵育二抗，并利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，Image J 軟件分析圖片灰度值。

2.5免疫熒光細(xì)胞種植于內(nèi)含蓋玻片的24孔板內(nèi)，24 h后，用4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同時(shí)加入以上兩個(gè)濃度的NCTD和DDP處理A549細(xì)胞60 h。除去培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，加入100 μL Vazyme試劑盒中的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，輕輕混勻，避光，室溫反應(yīng)10 min，取出蓋玻片并置于載玻片上。樣品在1 h內(nèi)熒光顯微鏡檢測(cè)，Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度。

2.6熒光素報(bào)告基因檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，24 h后，用4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同時(shí)加入以上兩個(gè)濃度的NCTD和DDP藥物處理A549細(xì)胞60 h，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后，每孔加入200 μL的細(xì)胞裂解液，并達(dá)到室溫，取樣品50 μL，加入100 μL螢光素酶檢測(cè)試劑，用移液槍吹打均勻，測(cè)定RLU (relative light unit)。以細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.7細(xì)胞株轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板。細(xì)胞貼壁12 h后，每孔加入1.5 μg的pcDNA-Flag YAP質(zhì)?；? μg的小干擾RNA siYAP，然后每孔加入3 μL的Lipofectamine?2000 (Thermo公司)進(jìn)行細(xì)胞株轉(zhuǎn)染。細(xì)胞處理48 h后，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1YAP在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)且處于活化狀態(tài)RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，肺癌細(xì)胞A549、H1299、Calu6、H520中YAP的mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組細(xì)胞HBEC相比明顯增加(Fig 1A)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 1B)。且Western blot結(jié)果表明，肺癌細(xì)胞中YAP分子的蛋白水平與HBEC細(xì)胞相比，同樣明顯增加(Fig 1C)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 1D)。但是非活化形式的YAP即p-YAP的蛋白水平在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于正常的HBEC細(xì)胞(Fig 1C、1D)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YAP在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且處于活化狀態(tài)。

3.2YAP分子調(diào)控A549細(xì)胞的增殖RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明，利用小RNA干擾技術(shù)(siRNA)可降低YAP的表達(dá)水平，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-FlagYAP可增加YAP的表達(dá)水平(Fig 2A、2B)。CCK-8和MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，降低YAP的表達(dá)可明顯抑制A549細(xì)胞的增殖，過(guò)表達(dá)YAP可明顯促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖(Fig 2C、2D)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YAP分子調(diào)控A549細(xì)胞的增殖。

3.3NCTD聯(lián)合DDP增強(qiáng)A549對(duì)順鉑的敏感性且抑制細(xì)胞增殖CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，低濃度的NCTD(0～4 mg·L-1)和DDP(0～4 mg·L-1)不影響A549細(xì)胞的增殖能力，高濃度的NCTD(>8 mg·L-1)和DDP(>6 mg·L-1)隨著濃度的增加，對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用也隨之增加(Fig 3A、3B)。CCK-8和MTT檢測(cè)結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD(4 mg·L-1)和DDP(4 mg·L-1)可明顯抑制細(xì)胞的增殖(Fig 3C、3D)。以上數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP可增強(qiáng)A549對(duì)順鉑的敏感性，并且抑制細(xì)胞增殖。

Fig 1 Aberrant activation of YAP in lung cancer cells

A, B: The mRNA level of YAP was detected by RT-PCR assay in different lung cancer cells; C, D: The protein level of YAP was detected by Western blot in different lung cancer cells.**P<0.01vsnormal control HBEC cells.

Fig 2 YAP promoted cell proliferation in A549 cells

A, B: The mRNA and protein levels of YAP were detected in A549 cells by treatment with siRNA and stably expressing YAP.The cellular proliferation was detected by CCK-8 (C) and MTT assay (D) in A549 cells.**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 NCTD combined with low concentration of DDP enhanced sensitivity of DDP and inhibited cell proliferation in A549 cells

The cell proliferation was detected by CCK-8 assay in A549 cells treated with different concentrations of NCTD (A) and DDP (B).CCK-8 (C) and MTT assay (D) indicated that the treatment combined with low concentration of DDP and NCTD significantly arrested cell proliferation in A549 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3.4NCTD聯(lián)合DDP增強(qiáng)A549對(duì)順鉑的敏感性且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Western blot結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP上調(diào)細(xì)胞凋亡標(biāo)記物，即活化形式的cleaved caspase-3的表達(dá)水平(Fig 4A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4B)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP增加Annexin V的表達(dá)水平(Fig 4C)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4D)。以上結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP增強(qiáng)A549對(duì)順鉑的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.5NCTD聯(lián)合DDP增強(qiáng)A549對(duì)順鉑的敏感性且影響YAP的轉(zhuǎn)錄活性熒光素報(bào)告酶檢測(cè)結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP降低YAP的轉(zhuǎn)錄活性(Fig 5A)。RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP降低YAP的mRNA和蛋白水平(Fig 5B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 5C)。

3.6NCTD聯(lián)合DDP增強(qiáng)A549對(duì)順鉑的敏感性且降低YAP靶基因的表達(dá)YAP信號(hào)通路激活時(shí)，輔轉(zhuǎn)錄因子YAP與轉(zhuǎn)錄因子TEAD家族蛋白結(jié)合，調(diào)控下游靶基因CTGF和Cyr61等表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖和凋亡[3]。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP降低YAP靶基因CTGF和Cyr61的mRNA水平(Fig 6A、6B)。Western blot結(jié)果同樣表明，聯(lián)合用藥降低YAP靶基因的蛋白水平(Fig 6C、6D)

4 討論

肺癌是一種發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤。近年來(lái)，其發(fā)病率與死亡率在我國(guó)及世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)，目前，已成為我國(guó)最難治愈的腫瘤疾病。肺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，且多器官繼發(fā)性轉(zhuǎn)移，5年生存率很低，因此，肺癌是所有腫瘤中最難治愈的一種。本課題以肺癌細(xì)胞A549為研究?jī)?nèi)容，闡明YAP分子在肺癌細(xì)胞增殖和對(duì)順鉑敏感性中的分子機(jī)制，為肺癌的臨床治療和提高病人的生存期具有非常重要的意義。

Fig 4 NCTD combined with low concentration of DDP induced apoptosis

A: The protein level of activated caspase-3 was detected by Western blot in A549 cells; B: The quantified results of A; C: The protein level of Annexin V was analyzed by immunofluorescent staining in A549 cells; D: The quantified results of C.**P<0.01vscontrol group.

YAP信號(hào)通路是近年來(lái)揭示出的控制細(xì)胞增殖與凋亡的內(nèi)在關(guān)鍵調(diào)控通路。YAP信號(hào)通路的核心蛋白分子元件包括兩種激酶MST和LATS，構(gòu)架蛋白SAV和MOB以及轉(zhuǎn)錄復(fù)合體YAP和TEAD。YAP為輔助轉(zhuǎn)錄激活因子， 其被LATS磷酸化后滯留在細(xì)胞質(zhì)中，隨后被降解，從而失去其在細(xì)胞核中與TEAD結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的活性。YAP作為一個(gè)潛在癌基因，一方面YAP與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活因子TEAD家族蛋白結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種癌基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。所以YAP功能失調(diào)后，促進(jìn)細(xì)胞增殖，有利于正常細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化[1-3]。另一方面，YAP促進(jìn)凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[2-5]。鑒于YAP在增殖和凋亡過(guò)程中的作用，說(shuō)明YAP在維持組織器官的穩(wěn)定性和正常的生理活動(dòng)中具有非常重要的作用。

盡管順鉑作為治療肺癌首選的化療藥物在臨床上得到了廣泛運(yùn)用，但使用高濃度的順鉑引起的化療耐受增加了肺癌病人的死亡率，是目前導(dǎo)致肺癌化療失敗的重要原因。如何有效地降低DDP的耐受性，緩解使用DDP對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的傷害是DDP臨床應(yīng)用所要解決的新問題。本研究表明，YAP在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)且處于活化形式，過(guò)表達(dá)YAP后促進(jìn)了A549細(xì)胞的增殖，說(shuō)明YAP在肺癌的發(fā)生與進(jìn)展中可能起著非常重要的作用。高濃度的DDP能夠抑制細(xì)胞的增殖，但是其加劇了細(xì)胞的耐受性和對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的傷害。課題組前期發(fā)現(xiàn)，NCTD通過(guò)調(diào)控YAP活性抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。因此，我們聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP處理細(xì)胞。結(jié)果表明，低濃度的聯(lián)合用藥明顯抑制細(xì)胞的增殖，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP抑制YAP的轉(zhuǎn)錄活性，并降低YAP靶基因CTGF和Cyr61的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡。

Fig 5 NCTD combined with low concentration of DDP significantly decreased YAP activities

A: The transcriptional activities of YAP promoter was examined by luciferase reporter gene assays in A549 cells; B: The mRNA and protein expressions of YAP were analyzed by RT-PCR and Western blot in A549 cells; C: The quantified results of B.**P<0.01vscontrol group.

綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用低濃度的NCTD和DDP可抑制YAP轉(zhuǎn)錄活性，降低YAP靶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，最終增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。本研究為肺癌的臨床治療中聯(lián)合應(yīng)用DDP和NCTD提供了新的治療思路及理論基礎(chǔ)。

Fig 6 NCTD combined with low concentration of DDP significantly decreased expression of YAP target genes of CTGF and Cyr61 in A549 cells

The mRNA and protein expression of CTGF and Cyr61 were analyzed by RT-PCR (A) and Western blot (C) in A549 cells; B, D: The quantified results of A and C.**P<0.01vscontrol group.

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