載腺嘌呤甘草次酸修飾透明質(zhì)酸納米粒的制備及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

吳 菲，張龍?bào)J，李肖成，蔣 彬，鄒斯亦，王 晨，牟文清，連 波，武敬亮，于文靜，高志芹

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省教育廳高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物藥物實(shí)驗(yàn)室；2.藥學(xué)院，山東 濰坊 261053)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1-3]，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為僅次于胃癌和食道癌的第3大常見(jiàn)惡性腫瘤。目前，腫瘤分子靶向治療與激素治療、免疫治療和細(xì)胞毒化療藥治療，共同構(gòu)成了現(xiàn)代腫瘤藥物治療的主要治療手段。已上市的抗腫瘤藥物雖然繁多，但是普遍存在選擇性低、對(duì)正常組織毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥等缺點(diǎn)。對(duì)于一些多功能高分子聚合材料的設(shè)計(jì)，例如靶向給藥系統(tǒng)(targeting drug delivery system, TDDS)已經(jīng)成為目前研究的一大熱點(diǎn)，這種納米靶向給藥系統(tǒng)與傳統(tǒng)的游離分子給藥相比，具有靶向性、病變組織藥物的富集、提高藥效、降低毒副反應(yīng)等多種優(yōu)勢(shì)[4]，為腫瘤分子靶向治療的難題提供了解決的途徑。

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸組成的雙糖重復(fù)單元的酸性黏多糖[5]，因其具有高度親水性和靶向性，被廣泛認(rèn)為是一種具有前瞻性的納米粒組成成分[6]。HA存在于大多數(shù)人體組織的細(xì)胞外基質(zhì)和關(guān)節(jié)滑液中，具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物低毒性[6]，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)方面。HA能與細(xì)胞表面CD44受體相結(jié)合[7-8]，因此，廣泛應(yīng)用于抗癌藥物治療。目前，HA作為載體材料，與多柔比星[9]、紫杉醇[10-11]、丁酸和絲裂霉素C等抗癌藥物結(jié)合，有很好的抗癌效果。

甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)是五環(huán)三萜類化合物[12-13]，為甘草根部的主要成分，無(wú)毒且廉價(jià)，在傳統(tǒng)中藥處方中的應(yīng)用極其廣泛。由于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面存在大量的GA受體，使GA具有良好的肝組織分布特征，作為一種肝靶向小分子化學(xué)載體被廣泛研究。在該實(shí)驗(yàn)中，將疏水基團(tuán)GA連接到HA納米骨架中得到雙親性聚合物GA-HA，在水溶液中自組裝成納米粒，包載脂溶性藥物。

腺嘌呤(adenine, Ade)是核苷酸的堿性基團(tuán)，其磷酸鹽有刺激白細(xì)胞增生的作用，用于防治各種原因引起的白細(xì)胞減少癥，特別是由于腫瘤化療、放射治療等所造成的白細(xì)胞減少癥。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Ade通過(guò)干擾核酸代謝的方式，阻止腫瘤細(xì)胞分裂和增殖，是臨床用于升白細(xì)胞的藥物，也可以抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，并在一定程度上呈濃度與時(shí)間依賴性。但是，Ade不溶于水，且在體內(nèi)代謝非常迅速，并且有腎毒性，也不適合口服和注射，因此在該實(shí)驗(yàn)中，將其包載進(jìn)納米粒疏水內(nèi)核中，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，蓄積于靶部位，提高藥物治療效果。

1 材料

1.1細(xì)胞株與試劑人肝癌Bel-7402細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)生命典藏中心。低分子透明質(zhì)酸鈉(華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，0.89×106u，批號(hào)1604025)；4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMT-MM，上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)1212U0518)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)AC10205751)；胎牛血清(ExCell Bio公司，批號(hào)113E340)；透析袋MD25(MWCO：3500，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)605A0201)；其他試劑均為分析純。

1.2儀器DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Mercury-plus400核磁共振儀(美國(guó)Varian公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS 90激光粒度儀(英國(guó)Malvern 公司)；JEM1400透射電子顯微鏡(日本Jeol公司)；TU-1810紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；CHRIST凍干機(jī)(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；

2 方法

2.1GA-HA、Ade/GA-HA納米粒的制備

2.1.1GA-HA納米粒的制備

2.1.1.1GA的活化 將1.41 g GA與0.967 g DMT-MM在30 mL甲醇中室溫?cái)嚢? h，TLC檢測(cè)完全生成GA-ES，旋蒸，將所得固體緩慢加入30 mL乙二胺中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜，TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢后，柱層析獲得純凈GA-NH2產(chǎn)物(Fig 1)。

2.1.1.2GA-HA納米粒的制備 向盛有10 mL蒸餾水的小玻璃瓶中加入60 mg(分子質(zhì)量為0.89 × 106u)HA，室溫下磁力攪拌器攪拌至溶解，在溶解的HA溶液中加入GA-NH28.43 mg，同時(shí)滴加適量的無(wú)水乙醇，攪拌2 h，至澄清的淺黃色溶解液。向溶解液中加入DMT-MM縮合劑，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。TLC(乙酸乙酯 ∶甲醇=2 ∶1)檢測(cè)反應(yīng)情況(Fig 2)。將反應(yīng)液裝入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的透析袋中，使用2 L蒸餾水透析，將透析后溶液冷凍干燥，即得理論取代度為10% GA-HA納米粒凍干品。

2.1.2Ade/GA-HA納米粒的制備 精確稱取GA-HA凍干品，溶于甲酰胺溶液中，配制成濃度為10 g·L-1的溶液；稱取Ade溶于1,2-丙二醇溶液中，配制成濃度為15 g·L-1的溶液。將上述兩種溶液以3 ∶1的體積比混合，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后將其裝入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的透析袋中，用2 L蒸餾水透析，探頭超聲分散15 min，最后冷凍干燥制得Ade/GA-HA納米粒。

Fig 1 Synthesis scheme of GA-NH2

Fig 2 Synthesis scheme of GA-HA nanoparticles

2.2納米粒的表征

2.2.1核磁共振表征、紫外/可見(jiàn)分光光度吸收分析 精確稱取樣品HA、GA-HA、GA、GA-NH2分別溶解于D2O和CD3Cl中，濃度為30 g·L-1，用核磁共振儀分析樣品的結(jié)構(gòu)特征，得到各樣品的核磁共振圖譜；將GA-NH2、HA、GA-HA納米粒分別溶解成一定濃度，利用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)這3種物質(zhì)在190～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光度掃描。

2.2.2GA取代度計(jì)算 精確稱取GA-HA凍干品，溶解于蒸餾水中，配制成終濃度為1 g·L-1的溶液。紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定GA-HA納米粒溶液在260 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，利用GA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GA-HA納米粒中GA的含量，計(jì)算GA取代度。

2.2.3納米粒粒徑、Zeta電位、粒度穩(wěn)定性檢測(cè) 精確稱取GA-HA、Ade/GA-HA凍干品，溶解成終濃度為1 g·L-1的水溶液，探頭超聲15 min，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，利用激光粒度儀檢測(cè)納米粒的粒徑、Zeta電位。重復(fù)上述步驟，將制備好的1 g·L-1GA-HA溶液37℃靜置1周，利用激光粒度儀檢測(cè)不同溶解時(shí)間下樣品的粒徑大小，檢測(cè)GA-HA納米粒粒度穩(wěn)定性。

2.2.4納米粒形態(tài)學(xué)分析 稱取適量GA-HA、Ade/GA-HA凍干品，用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，取1滴于專用銅網(wǎng)上，靜置2 min后，用配制好的磷鎢酸染色，自然晾干，用透射電子顯微鏡觀察納米粒的外觀形態(tài)。

2.2.5Ade/GA-HA納米粒的載藥量和包封率測(cè)定 將載藥納米粒溶于1 mol·L-1HCl中，用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定300 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，利用Ade標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Ade的含量，計(jì)算出載藥納米粒的載藥量；利用高效液相色譜儀繪制Ade標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用超速離心法，計(jì)算出包封率。

2.2.6Ade/GA-HA納米粒的體外釋放分析 取Ade/GA-HA凍干品溶于5 mL PBS，裝在透析袋中，置于含50 mL PBS的錐形瓶中，在(37±1)℃、100 r·min-1條件下振蕩釋放，間隔一定時(shí)間取3 mL透析液，同時(shí)補(bǔ)充等量、等溫PBS，于260 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算累積釋放百分率，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積釋放百分率為縱坐標(biāo)，繪制體外釋放曲線。

2.2.7Ade/GA-HA納米粒的細(xì)胞毒性分析 取指數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402細(xì)胞接種于96孔板中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，將Ade、GA-HA、Ade/GA-HA用培養(yǎng)基稀釋成一系列濃度，每孔加樣100 μL，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24、48、72 h。在每孔中加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min后，置于酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

3 結(jié)果

3.1核磁共振、紫外吸收表征GA-NH2使用了質(zhì)譜和核磁表征，與文獻(xiàn)比對(duì)無(wú)誤(Fig 3A)。1H-NMR、紫外/可見(jiàn)吸收光譜證實(shí)GA-HA納米粒已成功制備。1H-NMR結(jié)果表明，與HA的1H-NMR相比，GA在1.1～1.6 ppm處有特征性吸收峰(對(duì)應(yīng)GA的甲基基團(tuán))，出現(xiàn)在GA-HA的1H-NMR圖譜中，證實(shí)GA-HA納米粒制備成功(Fig 3B)。紫外/可見(jiàn)吸收光譜圖結(jié)果表明，在256 nm波長(zhǎng)處，GA-HA納米粒的紫外/可見(jiàn)吸收光譜圖中出現(xiàn)GA-NH2特征吸收峰(Fig 3C)。

3.2GA取代度計(jì)算利用GA在260 nm波長(zhǎng)處的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=15.45X+0.281 8，R2=0.999 5)，計(jì)算出GA-HA納米粒中GA的取代度為(3.80±1.26)%(Tab 1)。

Tab 1 Size distribution and Zeta potential of

3.3納米粒粒徑、Zeta電位和粒度穩(wěn)定性檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果表明，GA-HA平均粒徑為(398.10±41.09) nm，PDI為(0.231±0.018)，Zeta電位值為(-34.20±3.04) mV，呈負(fù)電，主要是由于納米粒表面HA電離的羧基基團(tuán)引起的，且電位值較大，說(shuō)明納米粒子間的靜電斥力較大，物理穩(wěn)定性較好；納米粒包載模型藥物Ade后，平均粒徑為(176.52±7.98) nm，PDI為(0.269±0.029)，粒徑減小(Tab 1)。GA-HA納米粒室溫放置1周，粒度基本無(wú)變化，說(shuō)明在水溶液中具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性(Fig 4)。

3.4納米粒的形態(tài)學(xué)分析透射電鏡觀察結(jié)果表明，納米粒分散良好，外觀呈規(guī)則球形，粒子大小均一，與粒度分布圖(Fig 4)相比，TEM觀察到的納米粒粒徑小于DLS檢測(cè)出的粒徑，這是由于二者的樣本制備技術(shù)不同，DLS檢測(cè)結(jié)果是在溶液狀態(tài)下所得，TEM圖像是在樣品干燥后所得，這時(shí)候納米粒的親水外殼會(huì)收縮(Fig 5)。

Fig 3 Nuclear magnetic resonance (NMR) and UV-Vis absorption spectra

A:1H NMR and13C NMR spectra of GA-NH2; B:1H NMR spectra; C: The UV-Vis absorption spectra of HA, GA and GA-HA.

Fig 4 Particle size measured by Malvern laser particle size analyzer

Size distribution of GA-HA (A) and Ade/GA-HA (B); C: The stability of GA-HA nanoparticles at various incubation time(n=3).

3.6Ade/GA-HA納米粒的體外釋放分析體外釋放曲線表明，在前4 h內(nèi)，Ade/GA-HA納米粒存在突釋現(xiàn)象，Ade的釋放速度較快，累積釋放率增加；4 h后，Ade/GA-HA納米粒的累積釋放曲線變得逐漸平穩(wěn)，趨于零級(jí)釋放，表現(xiàn)出緩釋特性(Fig 7)。

3.7Ade/GA-HA納米粒的細(xì)胞毒性分析細(xì)胞毒性結(jié)果表明，空白GA-HA納米粒對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞的抑制率在20%以下，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Ade/GA-HA納米粒和Ade組，表明空白GA-HA納米粒對(duì)Bel-7402細(xì)胞未見(jiàn)明顯毒性作用；而Ade/GA-HA納米粒和Ade組對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制率較高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，均逐漸升高，表明載藥納米粒和Ade對(duì)Bel-7402細(xì)胞有抑制作用；且在相同的濃度和孵育時(shí)間下，Ade/GA-HA納米粒組對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制率均明顯高于Ade組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明載藥納米粒對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且抑制作用最強(qiáng)(Fig 8)。

Fig 5 Transmission electron microscopy of nanoparticles(×200 000)

A: GA-HA; B: Ade/GA-HA

Fig 6 The standard curve of adenine (HLPC)

Fig 7 In vitro release curve of Ade/GA-HA nanoparticles

4 討論

近年來(lái)，肝靶向給藥系統(tǒng)的研究受到廣泛關(guān)注。

Fig 8 The proliferatory effect of Bel-7402 cells treated with nanoparticles

*P<0.05,**P<0.01vsAde group

目前，受體介導(dǎo)的肝靶向給藥系統(tǒng)的研究主要是設(shè)計(jì)與合成適合的藥物載體，并將肝靶向配體與之結(jié)合，以期實(shí)現(xiàn)肝靶向給藥的作用。由于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面含豐富的半乳糖苷，因此，過(guò)去研究大多以抗體、半乳糖化合物為配體，以實(shí)現(xiàn)將藥物靶向輸送至肝臟。但是，大多數(shù)抗體是鼠源性的，存在生物安全性和生物相容性問(wèn)題，而且抗體成本高，不經(jīng)濟(jì)。1991年，Negishi等[14]發(fā)現(xiàn)，鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面存在大量GA結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)具有高度特異性。隨后的一些研究結(jié)果表明，GA修飾的高分子載體材料具有肝靶向性[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，GA分子結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)A環(huán)3-OH和E環(huán)30-COOH引入合適基團(tuán)后，GA的抗炎、抗腫瘤、抗病毒活性均提高，且表現(xiàn)出良好的肝靶向性[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，活化GA的E環(huán)30-COOH，以乙二胺作為連接臂結(jié)合到HA上，制備出水溶液中自組裝雙親性共聚物。

雙親性共聚物GA-HA納米粒中，GA作為疏水基團(tuán)形成疏水內(nèi)核，HA作為親水鏈伸展在外側(cè)形成納米?；竟羌?，脂溶性藥物Ade因疏水作用力而包裹于GA-HA納米粒的疏水內(nèi)核中，提高了Ade在納米粒中的包封率和載藥量。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，GA-HA納米粒能夠延緩藥物釋放，最大限度延長(zhǎng)藥物濃度的有效作用時(shí)間，提高療效。眾所周知，腫瘤微環(huán)境pH值低于正常組織液，而GA-HA納米粒中含有大量的酰胺鍵，在酸性環(huán)境中，酰胺鍵水解導(dǎo)致GA-HA納米粒骨架結(jié)構(gòu)破壞，使藥物加快釋放，我們有理由認(rèn)為GA-HA納米粒選擇性地在腫瘤組織中釋放藥物，減少對(duì)正常組織的損害。

GA修飾的HA納米粒對(duì)肝細(xì)胞的毒性較小，表明實(shí)驗(yàn)制備的GA-HA納米粒靶向藥物載體在一定程度上能應(yīng)用于生物領(lǐng)域，這正是由于我們選擇的高分子聚合納米材料HA具有良好的生物學(xué)特性。與游離Ade相比，甘草次酸修飾的HA納米粒包載的Ade對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，說(shuō)明經(jīng)過(guò)甘草次酸修飾的HA納米粒能延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，增強(qiáng)對(duì)肝癌組織的靶向作用，從而提高藥物作用療效。據(jù)研究，甘草次酸所表現(xiàn)出的靶向性可能是由于少部分甘草次酸存在于在納米粒表面造成的，且甘草次酸也具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤的作用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)Ade對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且有時(shí)間和濃度依賴性，但是其抑制肝癌細(xì)胞增殖的發(fā)生機(jī)制尚未清楚，接下來(lái)我們將從分子生物學(xué)和動(dòng)物學(xué)方面做進(jìn)一步的研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在山東省高校“十三五”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——生物藥物實(shí)驗(yàn)室完成，感謝中國(guó)海洋大學(xué)江濤教授對(duì)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)支持，感謝秦進(jìn)、崔德軒同學(xué)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的幫助。)

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