不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株miRNAs表達(dá)譜的差異性研究

孫嘉玲,文 彬,孫海濤, 陳冠新，楊雪梅，陳煒聰，安海燕，龐 杰，賀松其

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.中國人民解放軍第四五八醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510602)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，基于HCC起病隱匿、早期診斷困難、高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)的特性，導(dǎo)致每年死于HCC的人數(shù)高居世界惡性腫瘤死亡人數(shù)的第3位[1]。MicroRNAs(miRNAs)是一種高度保守的、非編碼的單鏈小RNA，通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)參與調(diào)控多種疾病的生理病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，在HCC中異常表達(dá)的miRNAs可作為致癌或抑癌基因，參與調(diào)控HCC的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲等[2]。但在目前已有的研究中，缺乏同時(shí)對不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株miRNA差異表達(dá)譜的分析比較。因此，本研究采用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法，對MHCC-97H(高轉(zhuǎn)移)、Hep3B(不轉(zhuǎn)移)兩種不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞L02比較，以及兩者相互比較的miRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行全面而系統(tǒng)的分析，對篩選HCC的診斷、治療及預(yù)后的有效指標(biāo)和尋找新的治療靶點(diǎn)具有十分重要的臨床意義。

1 材料

1.1細(xì)胞株肝癌細(xì)胞株Hep3B購自廣州浩瑪生物科技有限公司；正常肝細(xì)胞L02、肝癌細(xì)胞株MHCC-97H購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2試劑DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；TRIzol購自北京全式金生物有限公司；Agilent Human miRNA(V21.0)芯片、miRNA Complete Labeling and Hyb Kit及Gene Expression Wash Buffer Kit購自Agilent公司；miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒及引物購自上海生工生物工程股份有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)購自TaKaRa公司。

1.3儀器Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter)；Mx3005P熒光定量PCR儀(美國Agilent Stratagene)等。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株Hep3B(不轉(zhuǎn)移)、MHCC-97H(高轉(zhuǎn)移)及正常肝細(xì)胞L02用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞總RNA提取及質(zhì)量監(jiān)控常規(guī)收集細(xì)胞后，采用TRIzol一步法提取細(xì)胞中總RNA，具體操作按說明書進(jìn)行。所得總RNA使用Agilent Bioanalyzer 2100和NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)檢，檢測樣本的總量、RNA完整指數(shù)(RNA integrity number，RIN)、28S/18S以及A260/A280數(shù)據(jù)，質(zhì)檢合格的樣本可用于后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)。

2.3miRNA芯片分析采用Agilent公司生產(chǎn)的人miRNA(V21.0)芯片進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析。根據(jù)Agilent芯片配套試劑盒說明書，對實(shí)驗(yàn)樣本中的miRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記、芯片雜交及洗片后，用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，用Agilent Feature Extraction Software 10.7.1.1讀取數(shù)據(jù)，最后采用R語言程序包AgiMicroRna進(jìn)行歸一化處理[3]，所用的算法為Quantile。采用t檢驗(yàn)計(jì)算差異表達(dá)的miRNA(P<0.01)，篩選出差異表達(dá)2倍以上(Fold change值≥2或≤0.5)的miRNAs。

2.4熒光定量RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果按上述方法提取總RNA，按照miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒說明書，Poly A加尾法逆轉(zhuǎn)錄RNA。qRT-PCR過程按照說明書操作，qPCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，(95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s)40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參選用U6，內(nèi)參及目的miRNAs引物由上海生工生物工程股份有限公司提供。用2-△△CT法進(jìn)行相對定量分析。

2.5靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析采用TargetScan、miRanda、miRWalk、miRDB 4種靶基因預(yù)測軟件對經(jīng)過驗(yàn)證的差異表達(dá)明顯的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，對結(jié)果進(jìn)行重疊與篩選，選擇同時(shí)被2個(gè)以上miRNAs靶向的基因，運(yùn)用OmicshareTools(www.omicshare.com/tools)來構(gòu)建差異表達(dá)miRNAs與靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。篩選出的靶基因運(yùn)用David 6.8軟件(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行Gene Ontology(GO)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)分析。

3 結(jié)果

3.1樣本RNA質(zhì)量鑒定各組RNA樣本的RIN≥7.0，且28S/18S≥0.7，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，無過多的5S rRNA，表明RNA樣本完整性好，無明顯降解，符合后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)要求(Fig 1)。

3.2肝癌細(xì)胞株Hep3B(不轉(zhuǎn)移)與正常肝細(xì)胞株L02之間的miRNA差異表達(dá)譜與L02相比，在Hep3B中差異表達(dá)明顯的miRNAs共有46個(gè)(P<0.01，F(xiàn)old change≥2)，上調(diào)的miRNAs有20個(gè)，下調(diào)的miRNAs有26個(gè)。其中，上調(diào)、下調(diào)最明顯的5個(gè)miRNAs見Tab 1。

Fig 1 Results of sample RNA quality test

3.3肝癌細(xì)胞株MHCC-97H(高轉(zhuǎn)移)與正常肝細(xì)胞株L02之間的miRNA差異表達(dá)譜與L02相比，在MHCC-97H中差異表達(dá)明顯的miRNAs共有22個(gè)(P<0.01，F(xiàn)old change≥2)，上調(diào)的miRNAs有8個(gè)，下調(diào)的miRNAs有14個(gè)。其中，上調(diào)、下調(diào)最明顯的5個(gè)miRNAs見Tab 2。

3.4肝癌細(xì)胞株MHCC-97H(高轉(zhuǎn)移)與Hep3B(不轉(zhuǎn)移)之間的miRNA差異表達(dá)譜與Hep3B相比，在MHCC-97H中差異表達(dá)明顯的miRNAs共有90個(gè)(P<0.01，F(xiàn)old change≥2)，上調(diào)的miRNAs有46個(gè)，下調(diào)的miRNAs有44個(gè)。其中，上調(diào)、下調(diào)最明顯的5個(gè)miRNAs，見Tab 3。

3.5qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA芯片結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞相比，miR-192-5p、miR-215-5p在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株中都明顯上調(diào)，而miR-130a-3p及miR-196a-5p則都明顯下調(diào)，歸為組1。而在肝癌細(xì)胞株MHCC-97H(高轉(zhuǎn)移)與Hep3B(不轉(zhuǎn)移)比較的芯片結(jié)果中，miR-224-5p 在高轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞株MHCC-97H中明顯增高，而miR-146a-5p、miR-483-3p、miR-200b-3p則明顯降低，歸為組2。利用熒光定量RT-PCR法分別檢測組1、組2的miRNA差異表達(dá)情況，所得結(jié)果與芯片結(jié)果相一致，見Fig 2。

3.6差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測與生物信息學(xué)分析運(yùn)用miRanda、Targetscan、miRWalk、miRDB 4種靶基因預(yù)測軟件分別對組1、組2中差異表達(dá)miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果取交集，得到組1靶基因548個(gè)，組2靶基因996個(gè)。根據(jù)靶基因預(yù)測結(jié)果，選擇同時(shí)被同組2個(gè)以上miRNAs靶向的基因來構(gòu)建差異表達(dá)miRNAs與靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，見Fig 3。

Tab 1 Differential expression of miRNAs between liver cancer cell Hep3B and normal hepatocytes L02

Tab 2 Differential expression of miRNAs between liver cancer cell MHCC-97H and normal hepatocytes L02

Fig 2 Validation of miRNAs microarray data via n=3, normalized to U6)

A: The relative expression value of miR-192-5p, miR-215-5p, miR-130a-3p and miR-196a-5p in group 1.*P<0.05vsL02; B: The relative expression value of miR-224-5p, miR-146a-5p, miR-483-3p and miR-200b-3p in group 2.*P<0.05vsHep3B.

Tab 3 Differential expression of miRNAs between liver cancer cell MHCC-97H and Hep3B

Fig 3 Predicted target network of differentially expressed miRNAs

分別對組1、組2的miRNAs靶基因預(yù)測結(jié)果進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路分析。結(jié)果顯示，組1中miRNAs調(diào)控的靶基因功能主要富集于21個(gè)GO(P<0.01,Fig 4A)。其中12個(gè)GO涉及生物學(xué)過程(biological process, BP)，包括自噬體成熟、對苯丙胺的反應(yīng)、腺苷酸環(huán)化酶活性的激活等；5個(gè)GO涉及細(xì)胞組分(cellular component, CC)，包括細(xì)胞皺褶、受體復(fù)合物、核內(nèi)體、中心體、核漿；4個(gè)GO涉及分子功能(molecular function, MF)，包括Ral GTP酶結(jié)合、磷脂酰肌醇-3-磷酸結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、蛋白結(jié)合。組1的KEGG通路分析結(jié)果顯示，靶基因明顯富集于18條信號(hào)通路(P<0.01,Fig 4B),包括腫瘤相關(guān)通路、p53信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。組2中miRNAs調(diào)控的靶基因功能主要富集于66個(gè)GO(P<0.01,Fig 5A)。其中30個(gè)GO涉及生物學(xué)過程，包括α-β T細(xì)胞增殖的正調(diào)控、溶酶體運(yùn)輸、心內(nèi)膜墊發(fā)展、蛋白質(zhì)泛素化等；19個(gè)GO涉及細(xì)胞組分，包括細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒、Cul3-RING泛素連接酶復(fù)合體、髓鞘、泛素連接酶復(fù)合體、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等；17個(gè)GO涉及分子功能，包括異天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸蘇氨酸結(jié)合、棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性等。組2的KEGG通路分析結(jié)果顯示，靶基因明顯富集于3條信號(hào)通路(P<0.05,Fig 5B),分別為泛素調(diào)節(jié)蛋白水解通路、內(nèi)吞作用通路和Hippo信號(hào)通路。

4 討論

目前，大量研究表明，miRNAs的異常表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們先以正常肝細(xì)胞L02為對照組，運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)，分別篩選MHCC-97H、Hep3B兩種不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞L02相比的miRNA差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-192-5p、miR-215-5p、miR-130a-3p、miR-196a-5p在兩種肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)都明顯改變，并使用qRT-PCR對以上4個(gè)miRNAs進(jìn)行檢測驗(yàn)證，所得結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-192-5p在HCC組織及多種肝癌細(xì)胞株中都表達(dá)上調(diào)，可通過靶向調(diào)節(jié)SEMA3A的表達(dá)來促進(jìn)肝癌細(xì)胞HCCLM3的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[4]。miR-215-5p已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并發(fā)揮關(guān)鍵的促癌或抑癌作用，包括胃癌、HCC、食管腺癌、結(jié)腸直腸癌等[5]。作為HCC的致癌基因，過表達(dá)miR-215可明顯降低其靶基因PTPRT的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[6]。與癌旁組織相比，miR-130a在肝癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，且與腫瘤大小、腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移分期密切相關(guān)，伴有miR-130a低表達(dá)的肝癌患者的總生存期與miR-130a高表達(dá)的患者相比要明顯縮短[7]。miR-196a在多種腫瘤中都表達(dá)異常，包括乳腺癌、肺癌、宮頸癌、HCC、胰腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等[8]，但其在HCC中的作用機(jī)制尚不明確。

Fig 4 GO and KEGG pathway analysis on differentially expressed miRNAs of group 1

為進(jìn)一步研究與HCC轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)的miRNAs，本研究還分析比較了兩種肝癌細(xì)胞株MHCC-97H(高轉(zhuǎn)移)與Hep3B(不轉(zhuǎn)移)之間的miRNA差異表達(dá)譜。結(jié)果顯示，miR-224-5p 在高轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞株MHCC-97H中增高最明顯，而miR-146a-5p、miR-483-3p、miR-200b-3p則明顯下調(diào)。miR-224已被證實(shí)在HCC組織及肝癌細(xì)胞MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2中的表達(dá)均明顯增高，可下調(diào)其靶基因HOXD10的表達(dá)，通過miR-224/HOXD10/p-PAK4/MMP-9信號(hào)通路來增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力[9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a定位于人類染色體5q34(這個(gè)區(qū)域在人類腫瘤中經(jīng)常缺失)上，在HCC、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中表達(dá)降低[10]。已知miR-483-3p在HCC組織中與相鄰正常組織相比表達(dá)降低[11]，但目前尚缺乏其對HCC調(diào)控機(jī)制的研究。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)，而miR-200家族在HCC組織及細(xì)胞中表達(dá)普遍降低，是EMT的主要調(diào)節(jié)基因，可有效抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。miR-200家族由5個(gè)進(jìn)化上保守的成員組成，可分為兩群，包括位于染色體1p36的miR-200a、miR-200b和miR-429，及位于染色體12p13的miR-200c及miR-141。miR-200家族表達(dá)的缺失會(huì)導(dǎo)致ZEB1和ZEB2表達(dá)的上調(diào)，隨后導(dǎo)致E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT[12]。在本次實(shí)驗(yàn)中，與不轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞Hep3B相比，hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-200a-3p在肝癌細(xì)胞MHCC-97H中都是明顯降低的。

Fig 5 GO and KEGG pathway analysis on differentially expressed miRNAs of group 2

A: Top 27 of GO terms enriched in group 2(P<0.01); B: 3 KEGG pathway enriched in group 2(P<0.05, the -lgPis the negative logarithm ofP-value).

高通量測序與生物信息學(xué)分析常常相輔相成。在HCC中，生物信息學(xué)分析對篩選腫瘤診斷及預(yù)后標(biāo)志物、放化療敏感性相關(guān)基因和潛在異常通路等具有重要意義。本研究運(yùn)用miRanda、Targetscan、miRWalk、miRDB 4種靶基因預(yù)測軟件，分別對組1、組2中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，并分別對兩組靶基因結(jié)果進(jìn)行了GO富集分析和KEGG通路分析。在組1的GO富集分析的分子功能部分， Ral GTP酶結(jié)合條目的靶基因富集值最高。Ral GTP酶不僅可與特定的效應(yīng)器蛋白相互作用參與調(diào)控細(xì)胞的胞外分泌和相關(guān)的細(xì)胞活性，而且其被致癌基因Ras的異常激活還是腫瘤形成的主要原因，在多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲中起重要作用[13]。在生物學(xué)過程中，組1的靶基因主要富集于自噬體成熟條目，而組1的KEGG通路分析結(jié)果顯示，腫瘤相關(guān)通路和p53信號(hào)通路是組1中miRNAs的靶基因主要涉及的通路。p53基因不僅可作為腫瘤的抑癌基因，還參與了自噬的調(diào)控。Di等[14]研究發(fā)現(xiàn)，p53可通過調(diào)控其靶基因Rap2B(屬于Ras-相關(guān)GTP結(jié)合蛋白家族，并在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào))來抑制自噬。在組2的KEGG通路分析中，泛素調(diào)節(jié)蛋白水解通路是組2中miRNAs的靶基因主要涉及的通路，這與組2的靶基因GO富集分析結(jié)果相一致。GO富集分析結(jié)果顯示，組2中的靶基因也與蛋白質(zhì)泛素化、Cul3-RING泛素連接酶復(fù)合體、泛素連接酶復(fù)合體等密切相關(guān)。因此，組2中的miRNAs可能是通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化來調(diào)控HCC的轉(zhuǎn)移侵襲。蛋白質(zhì)泛素化是一種不涉及到溶酶體的降解蛋白質(zhì)的作用，是真核生物中一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后修飾，其過程由一系列酶聯(lián)反應(yīng)催化而成。其中，泛素連接酶E3(E3 ubiquitin ligases)中的RING-finger E3s參與調(diào)控了許多細(xì)胞的生物過程，包括細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA損傷應(yīng)答、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和基因組穩(wěn)定性的維護(hù)等，其功能異常會(huì)導(dǎo)致多種惡性腫瘤(包括HCC)的發(fā)生[15]。

綜上所述，本研究運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)對不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株的miRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行篩選，對篩選診斷HCC靈敏的生物指標(biāo)和有效的治療靶點(diǎn)具有十分重要的臨床意義。基于本課題組前期在鱉甲煎丸抗肝癌研究中的良好工作基礎(chǔ)，今后，本課題組將通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些差異表達(dá)的miRNAs對HCC的調(diào)控作用及分子機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上觀察鱉甲煎丸對這些差異表達(dá)miRNAs的影響，深入研究鱉甲煎丸抗肝癌轉(zhuǎn)移侵襲的分子機(jī)制，有助于進(jìn)一步詮釋鱉甲煎丸多途徑、多層次抗肝癌的科學(xué)內(nèi)涵。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝賀松其教授課題組的老師和同學(xué)的盡心協(xié)助，以及文彬老師、安海燕老師、龐杰老師的悉心指導(dǎo)。)

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