丹皮酚激活CKIP-1對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞纖維化的影響

張 蕾，鄒葉子，公文艷，陳志泉，黃河清

(中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的“微血管綜合癥”之一，是目前導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，也是導(dǎo)致糖尿病患者致死、致殘的重要原因。DN亦稱為糖尿病腎小球硬化癥，其主要病理改變是腎臟纖維化。DN早期特征性的表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells, GMCs)增殖、腎小球肥大，晚期逐漸發(fā)展為腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)進(jìn)行性積聚如纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，以及細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhension molecule-1，ICAM-1)等炎性纖維化成分表達(dá)增加，最終發(fā)展成為以腎小球硬化為主要特征的腎實(shí)質(zhì)損害[1-2]。研究資料表明，DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是多種因素綜合作用的結(jié)果，包括高血糖、高血脂、活性氧及炎癥因子等[3]。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1)作為一種酪蛋白激酶2(casein kinase 2，CK2)α亞基的相互作用蛋白而被首次發(fā)現(xiàn)。作為一個(gè)支架蛋白，CKIP-1可與CK2α、caspase等多種蛋白結(jié)合，在細(xì)胞生長、凋亡、骨形成等過程中發(fā)揮重要的作用[4-5]。近年來研究表明，CKIP-1具有明確的抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)脂肪生成、抗炎效應(yīng)[6-7]。我們課題組的前期研究表明，CKIP-1可通過調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路，減少FN、ICAM-1的蛋白表達(dá)，在DN中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用[8]。

丹皮酚(paeonol，PA)是一種從中藥徐長卿和牡丹皮的干燥根皮中分離得到的小分子酚類化合物，研究表明其具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等[9-11]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚有潛在的腎臟保護(hù)作用，能降低高糖誘導(dǎo)下GMCs中FN和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達(dá)[12]，但具體調(diào)控機(jī)制未有報(bào)道。丹皮酚發(fā)揮腎臟保護(hù)作用是否與激活CKIP-1，活化Nrf2通路相關(guān)，有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究主要探討丹皮酚是否能通過激活CKIP-1，活化Nrf2信號(hào)通路，改善高糖誘導(dǎo)的GMCs纖維化。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)GMCs由大鼠腎臟皮質(zhì)部分離獲得，培養(yǎng)于含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基。細(xì)胞孵箱維持5% CO2和37℃培養(yǎng)條件。取3～12代間的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，按照1 ∶6比例傳代。

1.2藥物與試劑丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品，規(guī)格50 mg(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110708-201407)。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Lipofectamine?RNAiMAX(美國Invitrogen公司)；DHE(碧云天公司); FN、ICAM-1抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；CKIP-1抗體(Abcam公司)；超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、Nrf2抗體(Proteintech 公司)；血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)抗體(美國Abclone公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Promega公司)。

1.3藥物處理以合適的密度在培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長匯合度到60%左右時(shí)，將完全培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基DMEM，饑餓處理過夜，然后進(jìn)行后續(xù)處理。丹皮酚用DMSO配成20 g·L-1母液，儲(chǔ)存于-80℃，臨用前用無血清培養(yǎng)基DMEM稀釋成相應(yīng)濃度。不同濃度的丹皮酚預(yù)處理2 h后，再給予相應(yīng)刺激。

1.4siRNA干擾實(shí)驗(yàn)上海吉瑪有限公司設(shè)計(jì)合成3對CKIP-1小分子干擾序列(siCKIP-1)。經(jīng)篩選得到干擾效率最高的序列S2，其序列如下：5′-CUCCGGAAAUCCAAGAGUATT-3′，3′-UACUCUUGGAUUUCCGGAGTT-5′。當(dāng)細(xì)胞融合度在50%左右開始轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine?RNAiMAX試劑盒說明書進(jìn)行。將5 μL相應(yīng)干擾序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，置于孵箱培養(yǎng)36 h，無血清處理12～14 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，而后收獲細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5免疫印跡法(Westernblot) 各組細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)后，PBS沖洗3次，用細(xì)胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑cocktail)刮下細(xì)胞于1.5 mL EP管中，冰上裂解30 min。12 000×g、4℃離心15 min取上清。用BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組上樣15 μg，經(jīng)5%濃縮膠，8%或10%分離膠SDS-PAGE電泳分離蛋白(FN、ICAM-1、Nrf2用8%分離膠，CKIP-1、HO-1、SOD1用10%分離膠)。220 mA、1 h條件下將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后室溫封閉1 h，TBST沖洗3次后，4℃孵育相應(yīng)的抗體過夜。次日用對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h后，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液孵育2 min后，用Image Quant LAS4000mini(USA)儀器檢測蛋白條帶。

1.6超氧化物含量檢測按照1 ∶1 000比例用無血清DMEM稀釋熒光探針DHE，使其終濃度為10 μmol·L-1。細(xì)胞經(jīng)過各種因素處理后，吸棄培養(yǎng)基，用無血清的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2次。將培養(yǎng)皿置于冰上，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋好的DHE探針37℃孵育30 min，期間不時(shí)晃動(dòng)培養(yǎng)板使混勻。用高內(nèi)涵系統(tǒng)ArrayScan VTI 600 plus檢測細(xì)胞熒光密度。

1.7過氧化氫(H2O2)含量檢測按照碧云天過氧化氫檢測試劑盒說明書，首先校準(zhǔn)試劑盒內(nèi)的1 mol·L-1過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)際濃度。然后測定1～100 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測時(shí)每孔加入50 μL樣品和100 μL檢測試劑，輕搖，室溫靜置30 min后，檢測560 nm波長下的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組過氧化氫濃度。

2 結(jié)果

2.1丹皮酚降低高糖誘導(dǎo)的超氧化物、H2O2水平GMCs內(nèi)的超氧化物和H2O2含量能反映胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。如Fig 1所示，給予高糖刺激12 h后，GMCs內(nèi)超氧化物、H2O2水平明顯提高，給予丹皮酚預(yù)處理2 h,再給予高糖處理12 h后，與高糖組相比，丹皮酚能明顯降低胞內(nèi)超氧化物、H2O2含量。

Fig 1 Effects of paeonol on superoxide(A) and H2O2(B) levels in GMCs n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHG

2.2丹皮酚降低高糖誘導(dǎo)的FN、ICAM-1水平高糖刺激GMCs 24 h后，F(xiàn)N、ICAM-1蛋白表達(dá)明顯高于正常水平；丹皮酚(5、10、20 mg·L-1)明顯降低FN、ICAM-1蛋白水平(Fig 2)。

Fig 2 Effects of paeonol on FN and ICAM-1 expressions in HG-induced GMCs n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHG

2.3丹皮酚對高糖誘導(dǎo)的GMCs內(nèi)CKIP-1、Nrf2蛋白表達(dá)的影響Fig 1、2結(jié)果顯示，丹皮酚能降低高糖刺激下GMCs內(nèi)超氧化物、H2O2水平，最終降低FN、ICAM-1蛋白水平。我們進(jìn)一步探討了丹皮酚對CKIP-1介導(dǎo)的Nrf2信號(hào)通路的影響。Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞6 h后，模型組CKIP-1水平和正常組相比差異無顯著性，丹皮酚(5、10、20 mg·L-1)明顯升高CKIP-1蛋白水平。短時(shí)間高糖刺激短暫性提高核內(nèi)Nrf2水平，丹皮酚處理組進(jìn)一步升高Nrf2核蛋白水平。

2.4丹皮酚對高糖誘導(dǎo)的GMCs內(nèi)HO-1、SOD1蛋白表達(dá)的影響接下來，我們檢測了丹皮酚對Nrf2下游靶抗氧化酶HO-1、SOD1表達(dá)的影響。如Fig 4所示，作為Nrf2抗氧化應(yīng)激通路的下游靶蛋白，HO-1在高糖誘導(dǎo)12 h后，表達(dá)輕微上調(diào)，而SOD1表達(dá)無明顯變化。不同濃度的丹皮酚均能明顯上調(diào)HO-1、SOD1蛋白表達(dá)。

Fig 3 Effects of paeonol on CKIP-1(A) and Nrf2(B) expressions in HG-induced GMCs n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHG

2.5敲低CKIP-1逆轉(zhuǎn)丹皮酚升高GMCs內(nèi)Nrf2、HO-1、SOD1蛋白表達(dá)的作用上述結(jié)果顯示，丹皮酚降低高糖誘導(dǎo)GMCs內(nèi)超氧化物、H2O2含量增加，抑制FN、ICAM-1纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。并且，丹皮酚能激活CKIP-1介導(dǎo)的Nrf2信號(hào)通路。為了更加明確CKIP-1在丹皮酚激活Nrf2通路中的作用，我們敲低CKIP-1，同時(shí)給予丹皮酚處理。Fig 5結(jié)果顯示，CKIP-1干擾序列的干擾效率達(dá)到了70%。相比于丹皮酚處理組，同時(shí)給予丹皮酚和siCKIP-1后，丹皮酚升高總Nrf2的作用被取消，且同時(shí)給予丹皮酚和siCKIP-1逆轉(zhuǎn)了丹皮酚誘導(dǎo)的HO-1、SOD1表達(dá)增加。

Fig 4 Effects of paeonol on HO-1 and SOD1 expressions in HG-induced GMCs n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHG

2.6敲低CKIP-1逆轉(zhuǎn)丹皮酚降低GMCs內(nèi)活性氧水平的作用Fig 6結(jié)果顯示，和單獨(dú)高糖刺激組相比，10 mg·L-1丹皮酚處理組能明顯降低高糖引起的GMCs內(nèi)超氧化物、H2O2含量的增加。然而，在給予siCKIP-1后，丹皮酚減少超氧化物、H2O2的作用被取消。

2.7敲低CKIP-1逆轉(zhuǎn)丹皮酚抑制GMCs中FN、ICAM-1表達(dá)的作用Fig 7結(jié)果顯示，同時(shí)加入siCKIP-1和丹皮酚后，GMCs中FN、ICAM-1蛋白表達(dá)水平較單純丹皮酚給藥組明顯升高。以上結(jié)果說明，CKIP-1/Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)了丹皮酚抑制高糖誘導(dǎo)GMCs中FN、ICAM-1表達(dá)上調(diào)的作用。

3 討論

大量臨床研究證明，高血糖是導(dǎo)致DN在內(nèi)的各種糖尿病血管并發(fā)癥的主要決定因子，高血糖培養(yǎng)環(huán)境能模擬DN時(shí)人體內(nèi)環(huán)境[13]。課題組的前期研究證實(shí)，30 mmol·L-1高糖可以成功誘導(dǎo)包括FN在內(nèi)的糖尿病腎臟纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯升高[14]。

CKIP-1廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞中，在各種細(xì)胞生理進(jìn)程，包括細(xì)胞生長、分化、凋亡、細(xì)胞骨架形成等中發(fā)揮重要作用。研究表明，用高脂飼料飼養(yǎng)的CKIP-1基因敲除鼠，其較野生小鼠脂肪沉積、體質(zhì)量和瘦素水平均明顯增加[7]。同時(shí)，CKIP-1能通過抑制TRAF6介導(dǎo)的Akt信號(hào)通路的激活，減少巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[15]。上述研究證實(shí)，CKIP-1在糖脂代謝、炎癥領(lǐng)域有明確的調(diào)節(jié)作用，而炎癥、糖脂代謝紊亂是DN的重要發(fā)病機(jī)制。我們前期的研究亦證實(shí)，在GMCs中，CKIP-1可通過活化Nrf2-ARE抗氧化應(yīng)激通路，減少細(xì)胞中ROS積聚，抵抗高糖誘導(dǎo)的GMCs中纖維化相關(guān)指標(biāo)FN、ICAM-1表達(dá)上調(diào)，最終阻抑DN的病理發(fā)展[9]。

Fig 5 Depletion of CKIP-1 blocks effect of PA on Nrf2 signaling pathway n=3)

A:The interfering sequences were screened by Western blot.NC: negative control siRNA; PC:positive control siRNA; S1, S2, S3: three pairs of siRNA oligonucleotides targeting CKIP-1.B: Effects of siCKIP-1 on expressions of Nrf2, HO-1 and SOD1.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHG;ΔP<0.05vsHG+PA.

Fig 6 Depletion of CKIP-1 blocks effects of PA on superoxide(A) and H2O2(B) levels n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHG;ΔP<0.05vsHG+PA

研究表明，丹皮酚能明顯降低高糖刺激的GMCs中ROS水平，以及高糖刺激下TGF-β1和FN的表達(dá)[13]，提示丹皮酚具有通過抗氧化、改善糖尿病狀態(tài)下GMCs炎性纖維化的藥理活性，然而，丹皮酚對糖尿病狀態(tài)下GMCs確切的調(diào)節(jié)作用及其抗氧化作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)主要觀察了丹皮酚能否通過激活CKIP-1/Nrf2抗氧化應(yīng)激通路，抑制高糖刺激下培養(yǎng)的GMCs中FN、ICAM-1等炎性纖維化成分表達(dá)增加。結(jié)果顯示，30 mmol·L-1高糖條件下，丹皮酚處理明顯降低了高糖刺激的GMCs中ROS水平，能夠明顯逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的GMCs中FN和ICAM-1表達(dá)的增加。此外，丹皮酚能激活CKIP-1，上調(diào)Nrf2信號(hào)通路蛋白表達(dá)，包括Nrf2及其下游靶蛋白HO-1、SOD1的表達(dá)。而干擾CKIP-1表達(dá)后，丹皮酚升高CKIP-1表達(dá)作用被取消，提高Nrf2、HO-1、SOD1蛋白表達(dá)的作用也同樣被抑制，最終逆轉(zhuǎn)了丹皮酚降低GMCs內(nèi)ROS的作用，丹皮酚抑制FN、ICAM-1表達(dá)的作用也被取消。這些結(jié)果提示，激活CKIP-1，上調(diào)Nrf2信號(hào)通路，可能是丹皮酚抵抗高糖誘導(dǎo)GMCs纖維化的機(jī)制之一。

Fig 7 Depletion of CKIP-1 blocks effects of PA on FN and ICAM-1 expressions n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHG;ΔP<0.05vsHG + PA

本研究初步闡明了丹皮酚抵抗高糖誘導(dǎo)GMCs中FN、ICAM-1的高表達(dá)，阻抑DN病理進(jìn)程的作用與其調(diào)節(jié)CKIP-1、激活Nrf2抗氧化通路密切相關(guān)，本研究為丹皮酚防治DN提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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