和厚樸酚對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病的干預(yù)作用

鐘淇濱，祝曙光，陸少君，蔡肇栩，臧林泉

(廣東藥科大學(xué)1.藥學(xué)院藥理系、2.附屬第一醫(yī)院胸心外科，廣東 廣州 510006)

銀屑病是一種慢性皮膚病，病情長(zhǎng)，容易反復(fù)發(fā)作，全球發(fā)病率為2%～3%[1]。有研究調(diào)查中國銀屑病的流行病學(xué)，在12 000例患者中，男女比例為1.49 ∶1，平均發(fā)病年齡男性為(30.2±14.5)歲，女性為(27.1±15.6)歲，常見部位在頭皮，表現(xiàn)為中度至重度銀屑病，多為尋常型銀屑病(96.5%)[2]。

咪喹莫特(imiquimod，IMQ)是一種小分子免疫調(diào)節(jié)劑，被美國FDA批準(zhǔn)用于治療尖銳濕疣。咪喹莫特能通過激活Toll樣受體，激發(fā)免疫系統(tǒng)，外用能上調(diào)表皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，誘導(dǎo)表皮細(xì)胞產(chǎn)生銀屑病樣的皮膚損傷[3]。因此，咪喹莫特局部涂抹是一種理想的小鼠尋常型銀屑病造模方法。

和厚樸酚(honokiol，HK)是厚樸的有效成分之一，有研究發(fā)現(xiàn)HK具有抗炎作用。原代培養(yǎng)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞，其中IL-1β、TNF-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)比正常人單核細(xì)胞高，HK能劑量依賴性降低IL-1β、TNF-α、GM-CSF的表達(dá)[4]。HK能通過PI3K/Akt、ERK1/2、JNK1/2[5]、p38[6]等信號(hào)通路，抑制脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、前列腺素E2和TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥。在小鼠腦缺血/再灌注炎癥模型中，HK能通過抑制NF-κB活性，降低一氧化氮、TNF-α的產(chǎn)生，保護(hù)小鼠腦細(xì)胞[7]。在K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病模型中，HK能抑制皮膚組織VEGFR-2的表達(dá)，治療銀屑病[8]。銀屑病是一種難以根治的非致命性疾病，而中藥具有安全性高、副作用少、不容易耐藥的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)先灌胃給予HK 5 d，使小鼠達(dá)到血藥穩(wěn)態(tài)濃度，然后使用咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠造模，觀察HK預(yù)防和延緩銀屑病進(jìn)展的作用，為將其開發(fā)成新藥或保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，共42只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(粵)2013-0002，于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2試劑HK(廣州市合誠化學(xué)有限公司，HS-170554)，咪喹莫特乳膏(湖北科益藥業(yè)股份有限公司，170502)，醫(yī)用凡士林(天津大茂化學(xué)試劑廠，20161101)，地塞米松磷酸鈉注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，51611071)，大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司,102604022)，膽固醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,J15120)，IL-17、IL-23、TNF-α、JAK、STAT3、NF-κB抗體(萬類生物科技有限公司)。

1.3儀器脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JJ-12J)，包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JB-P5)，病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，RM2016)，組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-P)，顯微鏡(CIC公司，XSP-C204)。

1.4藥物的制備稱取HK 270 mg、卵磷脂810 mg、膽固醇113.4 mg，混合，加入5 mL無水乙醇，攪拌加熱至50℃溶解。稱量30 mL PBS加熱至50℃，攪拌下滴加乙醇混合物，最后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，定容至30 mL，即得9 g·L-1HK脂質(zhì)體。按同樣方法制備3、1 g·L-1HK脂質(zhì)體和陰性對(duì)照脂質(zhì)體。

1.5動(dòng)物的分組、造模和給藥小鼠先灌胃給藥5 d，每天1次，灌胃量10 mL·kg-1，達(dá)到血藥穩(wěn)態(tài)濃度后，再用咪喹莫特乳膏涂抹背部造模7 d，d 13取皮膚組織。42只BALB/c小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組(Normal)、模型組(Model)、脂質(zhì)體溶劑對(duì)照組(Liposome)、地塞米松(dexamethasone，DEX)5 mg·kg-1陽性對(duì)照組、HK高、中、低劑量組(90、30、10 mg·kg-1)，共7組，每組6只。用剃毛刀和脫毛膏去除背部的毛發(fā)，露出2 cm×3 cm的皮膚區(qū)域。正常組每天灌胃生理鹽水，背部涂抹凡士林，持續(xù)12 d；模型組每天灌胃生理鹽水；Liposome組每天用脂質(zhì)體灌胃；DEX組每天DEX 5 mg·kg-1灌胃；HK高、中、低劑量組每天灌胃相應(yīng)劑量的HK。除正常組外，其余各組小鼠從d 6開始背部涂抹咪喹莫特乳膏60 mg·d-1，持續(xù)7 d。

1.6小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasisareaandseverityindex，PASI)評(píng)分從d 6咪喹莫特乳膏涂抹造模開始，每天觀察小鼠背部情況，按照PASI評(píng)分表，分別得出紅斑、皮厚、鱗屑的分值(0：無癥狀；1：輕度；2：中度；3：重度；4：極其嚴(yán)重)，相加得出總分，d 13解剖前拍照記錄。

1.7皮損處HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)小鼠處死后，按照九宮格法取皮損處組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。每組6張切片，隨機(jī)挑選3個(gè)視野，按照同一參數(shù)拍照記錄，另外拍攝血球計(jì)數(shù)板充當(dāng)參照物，利用Image Pro Plus 6.0的標(biāo)尺功能測(cè)量皮層厚度。

1.8免疫組織化學(xué)法觀察相關(guān)蛋白表達(dá)石蠟切片脫蠟至水后，加入3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3% BSA室溫封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗(HRP標(biāo)記)室溫孵育50 min，DAB染色、蘇木精復(fù)染。每組6張切片，隨機(jī)挑選3個(gè)視野，按照同一參數(shù)拍照記錄。用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行半定量分析，在Segmentation中使用HSI模式，H:0～30，S:0～255，I:0～230，并且根據(jù)照片微調(diào)。用irregular工具圈出真皮層組織，計(jì)算光密度總和(IOD SUM)、測(cè)量區(qū)域(Area)，算出平均光密度(mean density)：mean density=(IOD SUM)/Area。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理PASI、皮膚厚度、免疫組化半定量均采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)處理，如果方差齊，兩組間對(duì)比采用LSD檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)；如果方差不齊，則采用Games-Howell檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1HK對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的影響d 6開始在小鼠背部露出皮膚涂抹咪喹莫特乳膏，模型組和Liposome組從d 8開始皮膚出現(xiàn)微小鱗屑；d 10開始皮膚明顯增厚，鱗屑變成塊狀，伴有少量紅斑，兩組病情沒有明顯區(qū)別。DEX組鱗屑增生不明顯，皮膚沒有明顯變厚。HK高、中、低劑量組的病情隨劑量依賴性減輕(Fig 1)。PASI得分用Levene顯示方差不齊，采用Games-Howell方法統(tǒng)計(jì)。在d 13，各組紅斑沒有明顯區(qū)別；正常組和模型組之間鱗屑及肥厚有明顯差異，DEX組比模型組有改善；高劑量HK能降低PASI總分(P<0.05)，DEX也能明顯降低PASI總分(P<0.01)，見Fig 2。

2.2小鼠銀屑病皮損處HE染色及表皮厚度Fig 3的HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)d 13時(shí)，正常組表皮層僅為1～3層細(xì)胞，皮脂腺/毛囊呈長(zhǎng)條狀且中空；模型組和Liposome組表皮厚度為正常組表皮的4倍，角質(zhì)層出現(xiàn)角化不全，真皮層出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴隨很多細(xì)胞碎片，皮脂腺內(nèi)聚集大量死細(xì)胞，形成Munro微膿腫，在棘層上部出現(xiàn)Kogoj海綿狀微膿腫；HK組隨劑量依賴性減輕表皮層厚度，真皮層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，且皮脂腺導(dǎo)管未完全堵死；DEX組病情最輕，表皮層接近正常對(duì)照組，真皮層細(xì)胞堆積稍多，皮脂腺結(jié)構(gòu)也依然完好。各組之間皮層厚度差異有顯著性。模型組平均表皮厚度為正常組的4倍(P<0.01)，DEX組及HK高、中劑量組能明顯降低表皮厚度(P<0.01，P<0.05)；Liposome組、HK低劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 4。

Fig 1 Observation of back skin in mice (day 13)

A: Normal; B: Model; C: Liposome; D: DEX; E: HK 90 mg·kg-1; F: HK 30 mg·kg-1; G: HK 10 mg·kg-1.Model group skin was thickened, scales were massive, accompanied by a small amount of erythema.The symptoms of HK group decreased in a dose-dependent manner, DEX was the most similar to the normal group.

Fig 2 The PSAI scores in mice induced by IMQ

2.3小鼠銀屑病皮損處免疫組化以及半定量分析免疫組化圖中黃色是陽性表達(dá)，如Fig 5所示，正常組小鼠皮膚組織的棕黃色集中在棘層和皮脂腺/毛囊細(xì)胞，真皮層則是淡黃色；模型組和Liposome組的真皮層幾乎都是棕色；HK能劑量依賴性減少陽性反應(yīng)。從半定量數(shù)據(jù)上看，模型組的IL-17、IL-23、JAK、STAT3、NF-κB、TNF-α均比正常組明顯增高(P<0.01)；DEX和HK高劑量組能明顯降低各指標(biāo)(P<0.05)；HK低劑量組、Liposome組與模型組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 3 The histological changes of skin lesions in mice(HE, ×200)

A: Normal; B: Model; C: Liposome; D: DEX; E: HK 90 mg·kg-1; F: HK 30 mg·kg-1; G: HK 10 mg·kg-1.Infiltration of inflammatory cells occurred in the dermis of the model group with much cellular debris.A large number of dead cells accumulated in sebaceous glands, forming Munro microabscess.

Fig 4 The changes of epidermis thickness of mouse skin (n=6)

*P< 0.05,**P<0.01vsmodel

3 討論

HK是一種多羥基酚類化合物，水溶性不佳，可能導(dǎo)致生物利用度個(gè)體差異較大。因此，采用乙醇注入法制備一種脂質(zhì)體，從而避免了難溶藥物的灌胃損失問題，而設(shè)立的脂質(zhì)體溶劑對(duì)照組證明了卵磷脂等脂質(zhì)體成分并不能改善銀屑病，適宜各種難溶性藥物的灌胃給藥。連續(xù)局部外用咪喹莫特7 d能夠誘導(dǎo)皮膚銀屑病損傷，可能的機(jī)制是增強(qiáng)IL-23/IL-17炎癥軸及其下游JAK/STAT3、NF-κB、TNF-α的表達(dá)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病的發(fā)病和進(jìn)展與Th17細(xì)胞介導(dǎo)的IL-23/IL-17炎癥軸有關(guān)。有研究表明，在銀屑病患者中，IL-23、IL-12、TNF-α、IL-22、IL-17表達(dá)增加。IL-17是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，IL-17包括不同的亞型(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F)，IL-6和TGF-β誘導(dǎo)Th0細(xì)胞轉(zhuǎn)化成Th17細(xì)胞，而IL-23可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。IL-17結(jié)合IL-17受體后，募集NF-κB，激活MAPK通路。另外，IL-17也能激活JNK/ERK、JAK/STAT3通路，表達(dá)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)[9]。三硝基苯磺酸致小鼠結(jié)腸炎模型中，JAK/STAT表達(dá)增加[10]，NF-κB上調(diào)會(huì)加重心肌缺血/再灌注損傷[11]和免疫性肝損傷[12]，以上實(shí)驗(yàn)均表明JAK/STAT、NF-κB上調(diào)能介導(dǎo)各種炎癥。

目前已經(jīng)有針對(duì)IL-17/IL-23炎癥軸的治療銀屑病新藥進(jìn)行臨床試驗(yàn)。Brodalumab是一種人類抗IL-17受體(IL-17RA)單克隆抗體抑制劑，給藥12周后，PASI-75指數(shù)達(dá)到83%～86%[13]。Ixekizumab通過結(jié)合IL-17A，阻斷其與IL-17受體結(jié)合，治療銀屑病，目前已被美國FDA批準(zhǔn)上市[14]?？诜﨡AK1/2的抑制劑Baricitinib 12周后，8、10 mg組比安慰劑組明顯改善銀屑病癥狀[15]。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化說明HK能劑量依賴性地抑制炎癥通路IL-17/IL-23、JAK/STAT3、TNFα、NF-κB的表達(dá)，從而延緩咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病的進(jìn)展。DEX的抗炎作用效果最佳，可能跟糖皮質(zhì)激素除了能抑制IL-23/IL-17炎癥軸，還能抑制磷脂酶A2，從而減少前列腺素和白三烯等其他炎癥通路有關(guān)。但是糖皮質(zhì)激素類藥物具有廣泛的藥理作用，而且糖皮質(zhì)激素抗炎特異性低，不適宜長(zhǎng)期服用，HK能作為一種長(zhǎng)期控制銀屑病的協(xié)同藥物和補(bǔ)充方案，本實(shí)驗(yàn)為開發(fā)HK的新用途和新劑型提供了理論幫助。

Fig 5 Changes of protein expression in lesions of mouse skin(×200, n=6)

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在廣東藥科大學(xué)新藥篩選中心完成，感謝指導(dǎo)老師與各位實(shí)驗(yàn)室人員的幫助與支持！)

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