不同氮營養(yǎng)鹽濃度對斜生柵藻生長及化學(xué)組成的影響

羅曉霞，劉錦上，李長玲

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/廣東省藻類養(yǎng)殖及應(yīng)用工程技術(shù)中心，廣東 湛江 524088；2.茂名市金陽熱帶海珍養(yǎng)殖有限公司，廣東 茂名 525000）

在“藻類→浮游動物→魚類”的水生食物網(wǎng)環(huán)節(jié)中，初級生產(chǎn)者（藻類）營養(yǎng)的好壞是草食性浮游動物產(chǎn)量的限制因子之一［1-2］，而浮游動物的產(chǎn)量則影響了最上層營養(yǎng)級魚類的產(chǎn)量。初級生產(chǎn)者（藻類）的氮、磷含量決定了其作為浮游動物的食物質(zhì)量［3-6］。環(huán)境中氮缺乏會導(dǎo)致藻體的多不飽和脂肪酸（PUFAs）降低［7］，從而限制浮游動物的產(chǎn)量［8］。有研究發(fā)現(xiàn)藻體N含量越低，浮游動物的穩(wěn)定同位素δ15N值越高，浮游動物攝食不同氮含量的同一種藻類時，其穩(wěn)定同位素δ15N值變化范圍為0～6‰［9］。因此，初級生產(chǎn)者（藻類）的氮含量變化會影響整個水生食物網(wǎng)的生產(chǎn)力及營養(yǎng)級判斷，尤其在營養(yǎng)鹽濃度變化較大的水體。水體中營養(yǎng)鹽的含量不僅會影響藻類的生長率，同時還會影響藻類細(xì)胞的生化組成［5-6，10］。不同氮磷營養(yǎng)鹽濃度對米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）［11］、銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）［12］、剛毛藻（Cladophora glomerata）［13］、小球藻（Chlorella sp.）［14］等藻類生長的影響已有相關(guān)報道。藻類的生長速率也會影響藻體的 C、N、P 比值［10］。Hessen等［5］發(fā)現(xiàn)月牙藻（Selenastrum capricornutum）在不同磷營養(yǎng)鹽濃度下藻體C、N、P含量顯著不同。然而，目前對于不同氮營養(yǎng)鹽對藻類化學(xué)組成（C、N、P）含量的研究較少。因此，我們研究了不同濃度氮營養(yǎng)鹽對斜生柵藻生長和化學(xué)成分的影響，以期為水生食物網(wǎng)能量傳遞影響機制提供基礎(chǔ)參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藻種為斜生柵藻（Scenedesmus obliqnus），由暨南大學(xué)水生所藻種室提供，采用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

以BG11培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，用超純水配置成無氮培養(yǎng)基，再以NaNO3為氮源，通過添加不同體積的NaNO3得到不同氮濃度的培養(yǎng)液。試驗設(shè)7個初始氮質(zhì)量濃度處理：0.247、2.47、24.7、123.5 、247、370.5、740 mg/L，每個處理 3次重復(fù)。

接種培養(yǎng)：斜生柵藻擴大培養(yǎng)10 d后，選處于指數(shù)生長期的藻進行實驗。在無菌操作臺（VS-840K，蘇泰）把藻液加入配制好的不同氮質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液，起始藻密度控制在20×104個/mL。培養(yǎng)容器為1 000 mL 錐形瓶，每瓶藻液為400 mL，用光照恒溫培養(yǎng)振蕩器（TS-111GZ型）進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25（±1）℃，光照強度為2 800 lx，光暗比14 h∶12 h。培養(yǎng)6 d后，對藻類進行計數(shù)，測藻體N、P含量。

柵藻密度的計數(shù)：實驗結(jié)束時，取20 mL藻液，用魯哥氏液固定，并用血球計數(shù)板進行計數(shù)。

1.3 藻體N、P含量測定

藻體N、P含量的測定方法分別按國標(biāo)GB11894-89、GB111893-89的方法進行，用紫外分光光度計（UV-5500）進行測定。每個重復(fù)取10 mL藻液離心，然后把上層清液倒掉，再補充相同體積的超純水，如此反復(fù)離心2次后，補充超純水至10 mL。最后，用吸管把藻液打均勻，取1 mL測藻體N含量，取2 mL測藻體P含量。

1.4 藻體C含量的測量

實驗結(jié)束時，用預(yù)燃燒（45℃，4 h）的GF/F 膜（Whatman）抽濾50 mL藻液，置于60℃烘至恒重，經(jīng)CHNS/O 元素分析儀測其碳重。計算藻類平均生長率μ：

式中，t為藻類培養(yǎng)時間，N0為起始細(xì)胞數(shù)，Nt為培養(yǎng)時間t后的細(xì)胞數(shù)。

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 進行單因素方差分析，原始數(shù)據(jù)符合方差齊性，運用Tukey’s HSD法進行差異顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮濃度對柵藻生長的影響

從圖1可以看出，不同氮濃度對斜生柵藻的生長有顯著影響，在初始氮濃度為0.247～247 mg/L時，藻體生長率隨氮濃度的升高而升高，氮濃度為247 mg/L時，其生長率是最低氮濃度（0.247 mg/L）的2.6倍。然而，當(dāng)?shù)獫舛瘸^247 mg/L時，細(xì)胞生長率顯著下降，高氮濃度處理（370 mg/L及740 mg/L）的生長率顯著低于247 mg/L氮濃度處理。

圖1 不同氮濃度處理斜生柵藻的生長率

2.2 不同氮濃度對柵藻化學(xué)組成的影響

從表1可以看出，不同氮濃度對柵藻藻體N含量有顯著影響，在初始氮濃度為0.247～24.7 mg/L時，藻體單位體積N含量隨著初始氮濃度的增加而增加，但是隨著氮濃度繼續(xù)增加（≥24.7 mg/L），各處理柵藻N含量差異并不明顯。當(dāng)?shù)獫舛葹?.247 mg/L時，其單位細(xì)胞N含量顯著低于其他氮濃度處理。

表1 不同氮濃度處理柵藻藻體的N含量

不同初始氮濃度對柵藻藻體P含量影響顯著（表2）。隨著氮濃度的逐漸增加，柵藻單位體積P含量呈先增加后降低的趨勢。氮濃度為2.47～247 mg/L時單位體積P含量無顯著差異，均顯著高于最低氮濃度（0.247 mg/L）。但是當(dāng)?shù)獫舛仍龃笾?70～740 mg/L時，柵藻單位體積P含量則顯著下降，其值顯著低于其他氮濃度處理。

柵藻單位細(xì)胞P含量則隨著初始氮濃度的增加而急劇下降。最低氮濃度（0.247 mg/L）處理單位細(xì)胞P含量是最高氮濃度（740 mg/L）處理的8倍。

表2 不同氮濃度處理柵藻藻體的P含量

柵藻單位體積C含量隨著初始氮濃度的增加而增加，在氮濃度為247 mg/L時達(dá)到最高值，之后隨著氮濃度的繼續(xù)增加而下降（表3）。單位細(xì)胞C含量在低氮濃度下最高，隨后逐漸下降，在氮濃度為24.7～370 mg/L時達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。

表3 不同氮濃度處理柵藻藻體的C含量

不同氮濃度對柵藻C、N、P比率有明顯的影響，柵藻的C∶N∶P原子比隨著初始氮濃度的增加而增加（表4）。

表4 不同N濃度對柵藻藻體C∶N∶P比率的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 不同氮質(zhì)量濃度對斜生柵藻生長的影響

有研究表明，營養(yǎng)鹽濃度是影響藻類生長的重要影響因素［10-12，14-16］。在氮濃度為 0～1 g/L時，杜氏藻的細(xì)胞密度、生長率隨著氮濃度的增加而增加［17］。米氏凱倫藻的最高細(xì)胞密度和生長率在30～750，mg/L，NaNO3濃度間隨氮濃度的升高而升高［11］。本研究也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，在初始氮濃度為0.247～247 mg/L時，藻體細(xì)胞密度隨氮濃度的升高而升高。但是氮濃度過高也會抑制藻類的生長。杜氏藻在氮濃度超過1.0 g/L時，其生長下降［17］。米氏凱倫藻的細(xì)胞密度在氮濃度高達(dá)750～3 000 mg/L時隨氮濃度的升高而降低［11］。本試驗中，斜生柵藻的細(xì)胞密度在氮濃度為247 mg/L時達(dá)到最高峰，之后隨著氮濃度的增加而顯著下降。曹春暉等［11］認(rèn)為高氮磷條件會導(dǎo)致植物細(xì)胞單鹽毒害，從而抑制藻細(xì)胞的分裂，使藻細(xì)胞進入對數(shù)期時間推遲，從而使高氮條件下穩(wěn)定期細(xì)胞密度及生長率低于中氮磷條件。過高或過低的氮濃度條件下，培養(yǎng)液氮磷比的失調(diào)也是抑制藻類生長的原因之一。

不同氮磷比的營養(yǎng)鹽對藻細(xì)胞的生長有明顯影響，而不同的藻類，其生長的最適氮磷比不同［15］。新月柱鞘藻在營養(yǎng)鹽N∶P質(zhì)量比為160∶1 時，生長速率最快；而青島大扁藻和米氏凱倫藻分別在4∶1 和80∶1 的條件下生長速率最快［15］。豐茂武等［12-13］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)踪|(zhì)量比為40∶1時，銅綠微囊藻、剛毛藻的生長最佳。本試驗中培養(yǎng)液的N∶P質(zhì)量比隨著氮濃度的增高而增加，柵藻的生長趨勢則隨著培養(yǎng)液N∶P比的升高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，生長最佳的氮濃度（247 mg/L）所對應(yīng)的培養(yǎng)液N∶P質(zhì)量比為46∶1，與豐茂武等［12］的研究結(jié)果相似。本試驗中，初始氮濃度0.247～2.47 mg/L為斜生柵藻生長的限制因子，斜生柵藻在氮濃度為24.7～740 mg/L（培養(yǎng)液N∶P比為46∶1）時能正常生長，最佳生長氮濃度為247 mg/L。

本試驗發(fā)現(xiàn)柵藻在氮限制（氮濃度為0.247～2.47 mg/L）的情況下，藻體細(xì)胞比正常氮濃度下培養(yǎng)的藻體細(xì)胞個體更大，而且細(xì)胞蛋白核消失或變小。Hessen等［5］發(fā)現(xiàn)月牙藻（Selenastrum capricornutum）在磷限制的情況下，藻體細(xì)胞增大，出現(xiàn)細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象。Van Donk等［18］認(rèn)為綠藻在磷缺乏的情況下，藻體自身會存儲大量的碳作淀粉顆粒，因此導(dǎo)致細(xì)胞個體增大。Harrison等［19］發(fā)現(xiàn)藻類在氮限制的情況下，自身的碳水化合物增高，蛋白質(zhì)含量下降。我們在前期實驗發(fā)現(xiàn)柵藻在磷限制的情況下，藻體個體細(xì)胞增大，細(xì)胞壁增厚（待發(fā)表）。因此，在營養(yǎng)鹽限制條件下，某些微藻的細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生不同程度的變異，從而更加適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境。

3.2 不同氮質(zhì)量濃度對柵藻化學(xué)組成的影響

水體中營養(yǎng)鹽的含量不僅會影響藻類的生長率，同時還會影響藻類細(xì)胞的生化組成［5-6，10，20］。Hessen 等［5］發(fā)現(xiàn)月牙藻藻體的C、N、P含量與培養(yǎng)液中的磷濃度呈正相關(guān)。本試驗中隨著初始氮濃度的增加，單位體積柵藻的C、N、P含量顯著不同。在氮濃度為0.247～24.7 mg/L時，藻體單位體積N含量（mg/L）隨著初始氮濃度的增加而增加，但是之后隨著氮濃度繼續(xù)增加，各濃度處理間柵藻的N含量差異不明顯，因此，初始氮濃度24.7 mg/L為柵藻N含量吸收的飽合濃度。柵藻單位體積P含量（mg/L）隨著氮濃度的逐漸增加，呈先增加后下降的趨勢，因此，氮濃度太高抑制藻體P含量的增長。在氮缺乏時，柵藻個體細(xì)胞P含量（mg/cell）顯著增加，其細(xì)胞P含量是高氮濃度處理的8倍。表明在氮缺乏的情況下，細(xì)胞個體大量吸收周圍含量充足的磷元素，以達(dá)到體內(nèi)的生化平衡，這也是藻類自我調(diào)整的策略。

Redfield定律認(rèn)為，藻類細(xì)胞組成的原子比率為 C∶N∶P=106∶16∶1［10，21-22］。本試驗發(fā)現(xiàn)，在不同氮濃度下，藻體C∶N∶P原子比率不同，為10∶0.14∶1～62∶4.6∶1，其值與Redfield比值相距較大。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)外部營養(yǎng)源、光照強度超過藻類生長所需的條件時，Redfield 定律就失去其應(yīng)用范圍［5，12，23］。Goldman等［10］發(fā)現(xiàn)在沒有營養(yǎng)鹽限制、浮游植物生長率較高的環(huán)境，浮游植物的化學(xué)原子比通常趨向于Redfield比率C∶N∶P=106∶16∶1。海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）在生長率低于10%時，其N∶P原子比為5∶1；當(dāng)生長率高于90%時，N∶P比為15∶1，逐漸接近Redfield比值的N∶P=16∶1。本試驗中，柵藻的生長周期為6 d，還未達(dá)到對數(shù)期，即生長率未達(dá)到最高，因此藻體的N∶P比值較低，未能體現(xiàn)Redfield值的定律。而在氮限制的情況下，藻體的C∶N∶P比值更低至10∶0.14∶1，表明藻體自身的N含量極低。有研究發(fā)現(xiàn)氮營養(yǎng)鹽不足，藻體的PUFAs含量急劇下降［7］，而藻類PUFAs含量決定了更高營養(yǎng)級浮游動物的產(chǎn)量［1，7，19］，因此環(huán)境中的氮濃度不僅影響藻類的生長、生化成分，而且進一步影響更高營養(yǎng)級浮游動物。不同氮含量的斜生柵藻對于浮游動物生長的影響還有待進一步研究證實，從而為水生食物網(wǎng)能量傳遞影響機制提供基礎(chǔ)參考資料。

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