UCA1和miR-141在膀胱癌細胞系和膀胱癌組織中的表達及與臨床預后的相關性

劉詠松，劉聰穎，陳孝斌

(宜賓市第二人民醫(yī)院泌尿外科，四川宜賓 644000)

膀胱癌(bladder cancer)屬于泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率第九[1]?？砂凑詹±眍愋蛣澐譃榘螂啄蚵飞掀ぐ?、鱗狀細胞癌、腺癌、透明細胞癌、小細胞癌、類癌[2]。其中，膀胱尿路上皮癌是最為常見的膀胱癌病理類型，約占90%以上[3]。膀胱癌的診斷目前還主要依賴于膀胱鏡檢查，但其在檢查過程中會對患者造成創(chuàng)傷，因此尋找新的診斷方法成為迫切需要。目前，盡管采用切除手術聯(lián)合化療對膀胱癌患者進行治療，然而由于膀胱癌易復發(fā)，發(fā)生侵襲和轉移，患者生存率仍然很低[4]。因此阻止癌癥發(fā)生侵襲和轉移成為治療膀胱癌的關鍵。腫瘤發(fā)生發(fā)展受多因素調節(jié)，除蛋白外，還有大量非編碼蛋白的RNA參與調節(jié)此過程。本研究擬探討尿路上皮癌抗原1(urothelial cancer associated1，UCA1)和miR-141在膀胱癌細胞和膀胱尿路上皮癌組織中的表達及與臨床預后的相關性，以期為膀胱癌的診斷與治療奠定數(shù)據基礎。

1 材料與方法

1.1組織標本收集宜賓市第二人民醫(yī)院2013年1月至2015年3月間收治患者的膀胱尿路上皮癌組織標本73例，其中男性患者62例，女性患者11例；年齡35～80歲，平均年齡(51.27±2.36)歲。選取標本患者經完整病例報告確認，術前未接受放療和化療。參照WHO標準進行病理分級：G1級22例、G2級34例、G3級17例；參照國際抗癌聯(lián)盟(union for international cancer control，UICC)標準進行臨床分期：T1期31例、T2期18例、T3期19例、T4期5例。另取，20例癌旁組織作為正常對照，均經病理組織學確認為正常組織。實驗選取標本均經所屬患者同意及宜賓市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準。自手術切除后，對患者分別進行為期2年的隨訪，其中存活33例，死亡40例。

1.2細胞株人膀胱尿路上皮癌細胞系：T24購自上海中喬新舟生物科技有限公司；UM-UC-3購自上海晶抗生物工程有限公司；BIU-87購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。人膀胱尿道正常細胞系：膀胱上皮細胞系(bladder epithelial cells，BEC)購自上海澤葉生物科技有限公司；人膀胱平滑肌細胞系(human bladder smooth muscle cells，HBd SMC)購自上海晶抗生物工程有限公司；尿道上皮細胞系(human urethral epithelial cells，HUEC)購自上海鈺博生物科技有限公司。

1.3主要試劑與儀器Trizol購自北京華邁科技生物技術有限責任公司；StarSpin Small RNA Kit購自上?？道噬锟萍加邢薰荆籐nRcute lncRNA cDNA購自天根生化科技(北京)有限公司；miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit購自北京百奧萊博科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Primix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；UCA1和miR-141引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成；Nanodrop 2000購自賽默飛世爾科技中國有限公司；熒光定量PCR儀購自艾本德中國有限公司。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應利用Trizol法和StarSpin Small RNA Kit分別提取組織或細胞的總核糖核酸(total RNA)和小分子核糖核酸(small RNA)，具體方法參照試劑盒說明書。Nanodrop 2000檢測總RNA質量，1.8

表1引物序列

引物名稱引物序列UCA1?正向引物5′?CTAGACCGGTTTCTCCTCATTC?3′UCA1?反向引物5′?GCGTGATTGGCGGTCAAAAGAG?3′miR?141?正向引物5′?CTCAAGGCAACCTACCGAAAAG?3′miR?141?正向引物5′?TATCGGACCCATCACGGAGTGG?3＇β?actin?正向引物5′?CAGGGCGTGATGGTGGGCA?3′β?actin?反向引物5′?GCTGTCAACCGTTCCAGGTCG?3′U6?正向引物5′?GATTAGAACCGTCGGTAACGGAA?3′U6?反向引物5′?AGCGATCTCGTTGGCCTTTCTACC?3′

2 結 果

2.1UCA1和miR-141在膀胱癌細胞中的表達 以BEC為對照組，檢測其余細胞系中UCA1和miR-141相對表達量。與BEC比較，UM-UC-3、BIU-87及T24中的UCA1和miR-141相對表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。非膀胱癌細胞HUC和HBdSMC中UCA1和miR-141相對表達量相較于BEC無顯著性差異(P<0.05，表2) 。

表2UCA1和miR-141在細胞中的表達

細胞UCA1miR?141 BEC1．01±0．110．99±0．12UM?UC?313．02±1．67?9．63±1．24?BIU?878．89±1．29?7．38±0．79?T2410．03±2．11?8．21±1．36?HUEC1．13±0．271．03±0．26HBdSMC0．97±0．181．15±0．29

與BEC相比，*P<0.05。

2.2UCA1和miR-141在膀胱癌組織中的表達膀胱尿路上皮癌組織中UCA1表達水平較正常癌旁組織明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。膀胱尿路上皮癌組織中miR-141表達水平較正常癌旁組織明顯升高(P<0.05，表3)。

2.3膀胱尿路上皮癌組織中UCA1、miR-141表達與臨床參數(shù)的關系以UCA1或miR-141相對表達量2-△△ct≥1為高表達，記為陽性。在膀胱尿路上皮癌組織標本中，UCA1陽性表達57例，miR-141陽性表達64例。UCA1、miR-141的表達同膀胱尿路上皮癌患者年齡、性別無顯著相關性(P>0.05)。UCA1的表達與病理分級、臨床分期及腫瘤轉移均具有顯著相關性(P<0.05)。miR-141的表達與臨床分期及腫瘤轉移均具有顯著相關性(P<0.05，表4)。

表3UCA1和miR-141在膀胱癌組織中的相對表達量

組織例數(shù)(n)UCA1miR?141膀胱尿路上皮癌組織7317．39±0．1611．62±0．67正常癌旁組織201．02±0．011．03±0．28t值455．50668．838P值0．0000．000

表4膀胱尿路上皮癌組織中UCA1、miR-141的表達與臨床參數(shù)的關系

(例)

2.4影響膀胱尿路上皮癌患者生存率的因素自膀胱尿路上皮癌患者進行切除手術開始，分別對73例患者進行隨訪，至2017年3月截止。73例患者中，存活患者33例，死亡患者40例，生存率為45.20%。膀胱尿路上皮癌患者生存率與患者的性別、年齡及病理分級之間無明顯相關性(P>0.05)。膀胱尿路上皮癌臨床分期T1～T2生存率為67.35%，顯著低于T3～T4期患者生存率(P<0.05)。UCA1高表達患者生存率為31.58%，顯著低于低表達患者(93.75%)(P<0.05)。miR-141高表達患者生存率為39.06%，顯著低于低表達患者(88.89%)(P<0.05)。見表5。

2.5影響膀胱尿路上皮癌患者生存率的Cox回歸分析Cox回歸分析顯示，影響膀胱尿路上皮癌患者預后的獨立危險因素分別有臨床分期、腫瘤轉移、UCA1和miR-141表達(表6)。

2.6膀胱尿路上皮癌組織中UCA1和miR-141表達的相關性通過進行Spearman秩檢驗結果顯示，膀胱尿路上皮癌組織中UCA1和miR-141表達呈現(xiàn)明顯正性相關(r=0.613，P<0.05)。

表5影響膀胱尿路上皮癌患者生存率的因素分析(例)

表6影響膀胱尿路上皮癌患者生存因素的Cox回歸分析

指標危險因素95%置信區(qū)間P值臨床分期11．6721．719～18．7100．001腫瘤轉移8．2891．419～11．9020．021UCA1表達2．6411．152～4．8760．014miR?141表達1．5611．014～3．6710．025

3 討 論

膀胱癌受多因素調節(jié)，除受DNA突變和蛋白質異常因素影響外，RNA異常也影響著膀胱癌的發(fā)生發(fā)展[5]。過往對腫瘤的研究主要集中于編碼蛋白的基因，隨著對腫瘤發(fā)病機制研究的深入，國內外專家也逐漸意識到非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[6]。相關研究指出，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)參與調控癌癥相關基因，未來有望成為腫瘤臨床診斷和治療的分子靶標[7]。LncRNA是一類非編碼RNA，廣泛存在于細胞內，其長度超過200核苷酸，參與調控遺傳印跡、染色質調控、轉錄調控等多種生物過程[8〗。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA失調與胃癌、非小細胞肺癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9-11]。隨著對LncRNA與腫瘤發(fā)病機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)LncRNA主要通過影響細胞表觀修飾、信號轉導通路及RNA編輯等方式調控腫瘤，具有腫瘤標志物的潛能[12]。

UCA1屬于LncRNA，位于19p13.12基因位點，含有3個外顯子和2個內含子[13]。LIU等[14]研究表明，UCA1在膀胱癌組織中呈特異性表達，且表達水平顯著高于癌旁正常組織。本研究對膀胱癌細胞及膀胱癌組織中UCA1的表達水平進行檢測，結果顯示，膀胱癌細胞系中UCA1的表達水平顯著高于非膀胱癌細胞系，且膀胱癌組織中UCA1的表達水平亦顯著高于正常癌旁組織，與過往研究一致。MILOWICH等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)腫瘤病理分級越高或臨床癥狀越嚴重，UCA1的陽性率越高；XUE等[16]研究發(fā)現(xiàn)UCA1對膀胱癌的轉移和侵襲具有促進作用。因此，為探索UCA1與膀胱癌之間的聯(lián)系，本研究對UCA1陽性表達與膀胱癌患者的臨床參數(shù)進行相關性分析，結果顯示，膀胱癌組織UCA1陽性表達與病理分級、臨床分期及腫瘤轉移情況顯著相關，進一步分析顯示其與患者兩年生存率密切相關，提示UCA1陽性表達率的升高與膀胱癌患者預后不良有顯著相關性。推測，UCA1可作為膀胱癌診斷及預后預測的分子標志物。

近年來，對微小RNA(MicroRNA,miRNA)在腫瘤中調控機制的研究較為廣泛，與LncRNA不同的是miRNA根據靶基因的不同，發(fā)揮不同的作用，既可以促進癌癥的進程也可以抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展，大量研究證實，miR-141在腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮著至關重要的轉錄調節(jié)作用[17-18]。miR-141屬于miR-200家族成員，位于12p 13.31位點。JAARSVELD等[19]針對卵巢癌細胞的研究表明，miR-141可通過NF-κB通路抑制KEAP1表達，增強卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性。ZHOU等[20]研究表明miR-141在胃癌組織中呈過表達，當下調miR-141表達水平時，胃癌細胞增殖能力明顯下調。本研究結果顯示膀胱癌細胞系及癌組織中miR-141表達水平較非膀胱癌細胞系及癌旁正常組織顯著升高，且膀胱癌組織中miR-141陽性表達與臨床分期及腫瘤轉移情況與miR-141陽性表達顯著相關，兩年內生存率相關性分析，提示miR-141陽性表達率的上調與膀胱癌患者預后不良有顯著相關性，推測miR-141可能為致癌基因，參與腫瘤轉移和侵襲，可作為膀胱癌的潛在分子靶標。

綜上所述，本研究結果顯示，UCA1、miR-141在膀胱癌細胞和膀胱尿路上皮癌組織中均呈高表達水平，UCA1、miR-141均與膀胱癌患者預后效果密切相關，對患者預后效果具有指示性作用，其中miR-141可能還具有促進癌癥發(fā)展的作用。本研究對UCA1和miR-141表達相關性進行分析，顯示UCA1與miR-141呈正相關性，其具體機制有待更深一步研究。

參考文獻：

[1] CLARK PE，AGARWAL N，BIAGIOLI MC，et al.Bladder cancer[J].J Natl Compr Canc Netw，2013，11(4):446-475.

[2] BURGER M，CATTO JW，DALBAGNI G，et al.Epidemiology and risk factors of urothelial bladder cancer[J].Eur Urol，2013，63(2):234-241.

[3] POWLES T，EDER JP，F(xiàn)INE GD，et al.MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer[J].Nature，2014，515(7528):558-562.

[4] KNOWLES MA，HURST CD.Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity[J].Nat Rev Cancer，2015，15(1):25-41.

[5] MORAIS D，REIS S，VIANA N，et al.1126 micro rna 100 role in the control of genes in bladder cancer cell lines[J].J Urol，2013，189(4):e460-e460.

[6] BAYSAL BE，SHARMA S，HASHEMIKHABIR S，et al.RNA editing in pathogenesis of cancer[J].Cancer Res，2017，77(14):3733-3739.

切，預后好[4,12]。而本文中病例2考慮到患者年齡較大，對側腎臟功能差，一期手術切除時結節(jié)切除完整，二期手術風險較大，故未行二期手術治療而予以密切觀察，目前隨訪沒有復發(fā)證據。

參考文獻：

[1] 那彥群，夏術階，陳方，等.泌尿男性生殖系先天性疾病診斷治療指南[M]//那彥群.中國泌尿外科疾病診斷治療指南,北京：人民衛(wèi)生出版社,2014：365-366.

[2] OH TH，SEO IY.The role of Bosniak classification in malignant tumor diagnosis：A single institution experience[J].Invest Clin Urol，2016，57(2):100-105.

[3] YUNG M，SONG GYU，LEE CHANG HEE，et al.Simple renal cyst (Bosniak classification type 1 cyst)：Is follow-up warranted？[J].Eur J Radiol Extr，2009，72(3)：e133-e135.

[4] 秦曉健,張海梁,葉定偉，等.囊性腎癌10年43例診治分析[J].中華泌尿外科雜志,2014，35(6):422-424.

[5] 高軍喜,賈志瑩,曾春紅，等.病灶內分隔的超聲及造影表現(xiàn)對多房囊性腎癌及腎囊腫的診斷價值[J].中國腫瘤學雜志,2014，41(14):917-921.

[6] PARK BK，KIM B，KIM SH，et al.Assessment of cystic renal masses based on Bosniak classification：Comparison of CT and contrast-enhanced US [J].Eur J Radiol，2007，61(2):310-314.

[7] HOMAYOON K，HARIKRISHNA D.Concurrent presence of cystic clear cell carcinoma posing as a simple cyst in a kidney with primary papillary carcinoma[J].Open J Urol，2012,02(2):78-80.

[8] QIN XJ，YE L，ZHANG HL，et al.Complicated variation of simple renal cyst usually means malignancy：results from a cohort study[J].Wold J Surgic Oncol，2014,12:316.

[9] SUZIGAN S，LOPEZ-BELTRAN A，MONTIRONI A，et al.Multilocular cystic renal cell carcinoma：a report of 45 cases of a kidney tumor of low malignant potential[J].Americ J Clinic Pathol,2006,215(2):217-222.

[10] NASSIR A，JOLLIMORE J，GUPTA R，et al.Multilocular cystic renal cell carcinoma：a series of 12 cases and review of the literature[J].Urology，2002，60(3):421-427.

[11] MOCH H，HUMPHREY P，ULBRIGHT T，et al.WHO classification of tumours of the urinary system and male genitalorgan[M].Lyon:International Agency for Research on Cancer (IARC) Press，2016：297.

[12] ZHANG J，LIU B，SONG N，et al.Diagnosis and treatment of cystic renal cell carinoma[J].World J Surg Oncol,2013,11:158.