KLF4及MMP2在膀胱癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系

盧湧湧 陶利萍 葉挺宇

[摘要] 目的 研究Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）及基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2，MMP2）在膀胱癌組織內(nèi)的表達(dá)，分析兩者間的相互關(guān)系，并探討其可能機(jī)制及臨床意義。 方法 收集2012年1月～2014年12月間115例膀胱癌患者的臨床資料及腫瘤特征，采用免疫組化法檢測(cè)膀胱癌組織內(nèi)KLF4及MMP2的表達(dá)，分析兩者之間的關(guān)系。 結(jié)果 KLF4在膀胱癌組織中表達(dá)顯著降低，與患者年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與性別、腫瘤大小、數(shù)目無(wú)關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)KLF4及MMP2在癌組織中的表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)。 結(jié)論 KLF4的低表達(dá)與膀胱癌的侵襲性增強(qiáng)密切相關(guān)，KLF4可能通過(guò)MMP2通路抑制了膀胱癌的侵襲性。

[關(guān)鍵詞] 膀胱癌；侵襲性；KLF4；MMP2

[中圖分類號(hào)] R737.14 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）07-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of Krüppel-like factor 4（KLF4） and matrix metalloproteinase 2 （MMP2） in bladder cancer tissues， to analyze the correlations between the two， and to explore its possible mechanism and clinical significance. Methods The clinical data and tumor characteristics of 115 bladder cancer patients from January 2012 to December 2014 were collected. Immunohistochemistry was used to detect the expression of KLF4 and MMP2 in bladder cancer tissues. The correlations between the two were analyzed. Results The expression of KLF4 was significantly lower in bladder cancer tissues， significantly correlated with patient's age， tumor invasion depth， histological type， and lymph node metastasis， but not correlated with gender， tumor size and number. Further analysis found that there was significant negative correlation between the expression of KLF4 and MMP2 in cancer tissues. Conclusion The low expression of KLF4 is closely correlated to the enhanced invasiveness of bladder cancer. KLF4 may inhibit the invasiveness of bladder cancer through the MMP2 pathway.

[Key words] Bladder cancer； Invasiveness； KLF4； MMP2

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，其中肌浸潤(rùn)性膀胱癌在接受了手術(shù)、放療、化療等綜合治療后，多數(shù)患者最終仍死于膀胱癌轉(zhuǎn)移，因此研究膀胱癌的侵襲性是改善膀胱癌預(yù)后的關(guān)鍵[1，2]。Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是一種進(jìn)化保守的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等過(guò)程中起重要作用，KLF4與多種腫瘤相關(guān)[3]。因此我們研究KLF4及基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2，MMP2）在膀胱癌組織內(nèi)的表達(dá)，分析兩者間的相互關(guān)系，并探討其可能機(jī)制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2012年1月～2014年12月間確診的膀胱癌患者115例，年齡39～81歲，平均63.4歲，男85例，女30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理確診為膀胱移行上皮癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他膀胱疾病史；②合并其他腫瘤病史；③合并其他可能影響研究結(jié)果的疾病。同時(shí)收集膀胱良性病變患者34例，年齡44～75歲，平均61.3歲，男32例，女12例，以膀胱遠(yuǎn)離病灶3 cm以上膀胱黏膜組織為正常膀胱黏膜對(duì)照組。兩組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

將膀胱癌患者癌組織蠟塊或正常膀胱黏膜組織蠟塊打孔取樣建立組織芯片，SP法免疫組化染色，IHS法半定量測(cè)定KLF4 及MMP2的表達(dá)情況。根據(jù)患者臨床資料，確定腫瘤大小、數(shù)目、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟第7版TNM分期法進(jìn)行分期，按WHO國(guó)際腫瘤組織學(xué)分類（2004）進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。

SP法免疫組化染色具體流程：組織芯片蠟塊進(jìn)行切片（4 μm/片），常規(guī)脫蠟水化，胃蛋白酶溶液消化，EDTA抗原液修復(fù)，一抗孵育過(guò)夜（4℃），二抗（50 μL，帶生物素標(biāo)記）孵育20～30 min，加入卵白素后室溫下孵育，確定顯色適時(shí)終止。IHS法半定量分析：①染色強(qiáng)度，以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)弱計(jì)分（計(jì)為a）：無(wú)明顯著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；②陽(yáng)性細(xì)胞率，即5個(gè)視野（每400×高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)此類細(xì)胞）的陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)（計(jì)為b）：1%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；③a×b乘積為IHS評(píng)分，IHS評(píng)分≤3分為陰性，>3為陽(yáng)性，其中≤6分為低表達(dá)，>6分為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢測(cè)采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和正常膀胱黏膜組織中KLF4與MMP2的表達(dá)

115例膀胱癌患者中63例表達(dá)KLF4陰性（54.78%），52例表達(dá)KLF4陽(yáng)性（45.22%），其中KLF4低表達(dá)41例（35.65%），高表達(dá)11例（9.57%）；34例正常膀胱黏膜組織中KLF4表達(dá)均陽(yáng)性，其中KLF4低表達(dá)15例（44.12%），高表達(dá)19例（55.88%）。統(tǒng)計(jì)表明癌組織內(nèi)KLF4的表達(dá)顯著低于正常膀胱黏膜（P<0.001）。而115例膀胱癌患者中80例表達(dá)MMP2陽(yáng)性（69.57%），其中MMP2低表達(dá)39例（33.91%），高表達(dá)41例（35.65%），MMP2陰性35例（30.43%）。34例正常膀胱黏膜組織中MMP2表達(dá)陰性21例（61.76%），陽(yáng)性13例（38.24%），且都為MMP2低表達(dá)者。統(tǒng)計(jì)表明癌組織內(nèi)MMP2的表達(dá)顯著高于正常膀胱黏膜（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 KLF4、MMP2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

膀胱癌組織中KLF4的表達(dá)與患者年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與患者性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目無(wú)關(guān)。膀胱癌患者中年齡≥60歲、腫瘤浸潤(rùn)性高（T2～T4）、腫瘤分化程度低（高級(jí)別）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，較年齡<60歲、腫瘤浸潤(rùn)性低（Ta～T1）、腫瘤分化程度高（低惡/低級(jí)別）、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的KLF4表達(dá)低，具有顯著性差異（P<0.05）。KLF4的表達(dá)與患者年齡、腫瘤的浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.243、-0.268、-0.307、-0.250（P<0.05）。

膀胱癌組織中MMP2的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目無(wú)關(guān)。膀胱癌患者中腫瘤浸潤(rùn)性高（T2～T4）、腫瘤分化程度低（高級(jí)別）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，較腫瘤浸潤(rùn)性低（Ta～T1）、腫瘤分化程度高（低惡/低級(jí)別）、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的MMP2表達(dá)高，具有顯著性差異（P<0.05）。MMP2的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.280、0.283、0.263。見(jiàn)表2。

2.3膀胱癌中KLF4與MMP2表達(dá)的相關(guān)性

在膀胱癌組織中，KLF4的陰性表達(dá)與MMP2的陽(yáng)性表達(dá)之間存在高度巧合。63例KLF4表達(dá)陰性的患者中，34例有MMP2的高表達(dá)，17例MMP2低表達(dá)，僅有12例MMP2表達(dá)陰性。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌患者癌組織中，KLF4與MMP2的表達(dá)之間存在顯著負(fù)相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.466（P<0.001）。見(jiàn)表3。

3討論

KLF4亦稱為胃腸富集Krüppel樣因子（GKLF），是KLFs家族的重要成員，KLF4在多種器官與組織中表達(dá)，包括皮膚、睪丸、乳腺、膀胱等，且KLF4的表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)[3]，在肺癌、食管癌、肝癌、腎癌、胃癌及結(jié)直腸癌中KLF4表達(dá)降低或缺失，KLF4起到抑制腫瘤的作用[4-8]，而在乳腺導(dǎo)管癌、頭頸部及皮膚鱗狀細(xì)胞癌中KLF4表達(dá)升高，KLF4起到促進(jìn)腫瘤的作用[9-11]，這些研究表明KLF4既可作為致癌基因也可作為抑癌基因，其作用結(jié)果取決于其所調(diào)控的基因及其所在腫瘤細(xì)胞的染色質(zhì)環(huán)境。

本研究檢測(cè)了KLF4在膀胱癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常膀胱黏膜組織，膀胱癌組織中的KLF4的表達(dá)顯著降低，與李凡等[12]的研究檢測(cè)膀胱癌組織內(nèi)KLF4 mRNA的結(jié)果類似。本研究還進(jìn)一步分析了KLF4表達(dá)量與膀胱癌臨床特征的關(guān)系，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者中年齡≥60歲、腫瘤浸潤(rùn)性高（T2～T4）、腫瘤分化程度低（高級(jí)別）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者KLF4表達(dá)顯著降低，提示KLF4表達(dá)的降低與膀胱癌的侵襲性增強(qiáng)有關(guān)，與KLF4在肺癌、食管癌、肝癌、腎癌及胃腸道腫瘤中的表達(dá)情況類似[4-8]。在胃癌、結(jié)直腸癌及髓母細(xì)胞瘤中，啟動(dòng)子甲基化可導(dǎo)致KLF4表達(dá)降低[4，13-15]，而在肝癌、肺癌、腎細(xì)胞癌亦存在KLF4啟動(dòng)子的超甲基化現(xiàn)象[6-7]。通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑抑制甲基化后，可恢復(fù)KLF4的表達(dá)，同時(shí)抑制結(jié)直腸癌和胃癌細(xì)胞系在體外和體內(nèi)致瘤性[13，16][Restoration 27，38]，提示KLF4啟動(dòng)子的甲基化是KLF4表達(dá)降低的重要原因。另外，KLF4基因雜合性缺失（LOH）和位點(diǎn)突變也可能導(dǎo)致KLF4表達(dá)的降低[4，13-15]，但有關(guān)膀胱癌中KLF4表達(dá)的降低機(jī)制目前尚不明確，仍需要進(jìn)一步研究。

MMP2是一種需要金屬離子作為輔助因子的蛋白酶，能夠降解基底膜的主要成分——Ⅳ型膠原，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，最終形成轉(zhuǎn)移灶[17]。MMP2與多種腫瘤包括膀胱癌密切相關(guān)，MMP2可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，MMP2高表達(dá)與膀胱癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，因此MMP2在膀胱癌的侵襲中起著關(guān)鍵的作用[18，19]。在本研究中我們同時(shí)檢測(cè)了MMP2的表達(dá)，結(jié)果表明在膀胱癌組織中，MMP2的高表達(dá)與膀胱癌侵襲性相關(guān)，并且MMP2的表達(dá)與KLF4的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。已有的研究顯示，MMP2 啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)KLF4結(jié)合位點(diǎn)，KLF4 可以通過(guò)直接結(jié)合MMP2的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其活性，降低其mRNA及蛋白的表達(dá)[20，21]。另外，KLF4 能夠抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail 等表達(dá)，而后者能夠顯著增加MMP2的表達(dá)，提示KLF4 能夠間接抑制MMP2的表達(dá)[22-23]。因此，我們推測(cè)KLF4通過(guò)直接或間接的方式抑制MMP2的轉(zhuǎn)錄從而抑制了膀胱癌細(xì)胞的侵襲性，但仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中KLF4的表達(dá)降低，并與膀胱癌的侵襲性增強(qiáng)有關(guān)，與癌組織中MMP2的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，KLF4通過(guò)可能抑制MMP2的轉(zhuǎn)錄從而抑制了膀胱癌細(xì)胞的侵襲性，KLF4可能是明確膀胱癌侵襲性的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

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（收稿日期：2017-12-21）