不同脫除劑對(duì)暫養(yǎng)紫貽貝體內(nèi)重金屬Cd2+的脫除效果

房傳棟,張 賓,呂丹丹,章樣揚(yáng),郝桂娟

(浙江海洋大學(xué) 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江舟山 316022)

紫貽貝(Mytilusedulis),俗稱淡菜、海虹,具有味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn),因而深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎。我國(guó)作為貽貝類(lèi)產(chǎn)品主要生產(chǎn)和貿(mào)易大國(guó),總產(chǎn)量連續(xù)多年居世界前列。紫貽貝屬濾食性生物、移動(dòng)性差,養(yǎng)殖基地大多在污染較重的近海區(qū)域,因此其在濾食鉺料的同時(shí),也大量富集了海水中重金屬、化學(xué)污染物等有害物質(zhì)[1]。

對(duì)于貝類(lèi)體內(nèi)重金屬(如Cd2+)、致病微生物等有害物質(zhì),可通過(guò)凈水暫養(yǎng)或凈化方式得以部分脫除,但其缺點(diǎn)是周期長(zhǎng)、損耗大,且會(huì)污染暫養(yǎng)區(qū)水質(zhì)[2]。許梓榮等[3]采用納米蒙脫石、氯化鈉和殼聚糖作為飼料添加劑,通過(guò)物理吸附可減輕Cd2+對(duì)貝、魚(yú)類(lèi)毒害作用,但其飼料配比復(fù)雜、吸附脫除作用有限。孫繼鵬等[4]制備的水溶性殼寡糖-金屬配合物,可置換貝體內(nèi)MT-Cd2+中的Cd2+離子,對(duì)櫛孔扇貝Cd2+具有一定脫除作用。程珊珊[5]用殼聚糖、N,O-羧甲基殼聚糖處理急性染Cd2+牡蠣,發(fā)現(xiàn)二者均可降低牡蠣體內(nèi)Cd2+含量,且N,O-羧甲基殼聚糖處理效果較佳。關(guān)于人體內(nèi)重金屬的脫除,主要是服用解毒劑,如環(huán)己烷二胺四乙酸、2,3-二巰基丙醇、二巰丁二酸等,其原理是靠其含有的巰基、氨基或羧基等爭(zhēng)奪與MT結(jié)合的重金屬離子,形成不溶性復(fù)合物而排出體外,但其脫除效果較為有限。目前,關(guān)于貽貝類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)重金屬安全脫除技術(shù)研究還較少,尋找有效降低紫貽貝體內(nèi)Cd2+的新方法對(duì)我國(guó)貝類(lèi)水產(chǎn)品安全具有重要意義。本文通過(guò)比較不同脫除劑對(duì)暫養(yǎng)紫貽貝體內(nèi)重金屬Cd2+的影響,旨在尋找一種有效的紫貽貝體內(nèi)Cd2+脫除劑及探索其應(yīng)用方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫貽貝 購(gòu)于舟山市東河菜場(chǎng)；殼長(zhǎng)(9.0±0.5) cm,殼寬(4.0±0.3) cm,殼高(7.0±0.4) cm,質(zhì)量(56.0±3.4) g,暫養(yǎng)水體取自舟山附近海域海水,經(jīng)沉淀、砂濾處理后進(jìn)行養(yǎng)殖紫貽貝，經(jīng)檢測(cè)分析,海水本底Cd2+<0.04 μg/L,pH7.8～8.0,鹽度29‰～31‰。氯化鎘、乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA-CaNa2) 上海沃凱化學(xué)試劑有限公司;β-葡聚糖 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;肽聚糖 鄭州歐科拜克生物技術(shù)有限公司;L-硒代蛋氨酸 江南化學(xué)試劑有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸鐵鈉(EDTA-FeNa)、乙二胺四乙酸鋅鈉(EDTA-ZnNa)、亞硒酸鈉 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;硒化卡拉膠(DP 2～20,κ型) 上海甄準(zhǔn)試劑有限公司;氯化鐵、氯化亞鐵、高氯酸、硝酸等 國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

Direct-Q3U型超純水制備機(jī) 法國(guó)Millipore公司;MDF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司;Tube Mill 100 control型研磨機(jī) IKA集團(tuán);SH230N型重金屬消解儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;AA-7000型原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫貽貝暫養(yǎng) 將紫貽貝清除附著物后,置于直徑100 cm、高60 cm圓柱形聚乙烯暫養(yǎng)箱中。每箱添加海水40 L,紫貽貝暫養(yǎng)7 d。為避免殘餌及糞便影響,暫養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)期間不投喂餌料。暫養(yǎng)期間隔日更換新鮮海水,每次換水量為總體積的3/4,24 h持續(xù)通氧,定期剔除死亡及活力不強(qiáng)的紫貽貝個(gè)體。

1.2.2 紫貽貝Cd2+染毒 紫貽貝經(jīng)7 d暫養(yǎng)穩(wěn)定后,挑選活力較強(qiáng)、大小均一個(gè)體隨機(jī)放入養(yǎng)殖箱(30只/箱)。添加40 L含0.40 mg/L CdCl2養(yǎng)殖海水,持續(xù)通氧,隔日換0.40 mg/L CdCl2養(yǎng)殖海水3/4。Cd2+暴露染毒為期7 d,每天定期剔除死亡及活力不強(qiáng)個(gè)體。

1.2.3 紫貽貝Cd2+脫除 選取Cd2+染毒7 d后紫貽貝作為樣品,隨機(jī)進(jìn)行分組,每箱加水40 L含有以下不同脫除劑的海水,每3 d取樣1次。取樣時(shí)更換相應(yīng)的含有脫除劑的海水,持續(xù)通氧。每組取樣4只紫貽貝,用超純水沖洗干凈,解剖后備測(cè)。

實(shí)驗(yàn)分組:空白組:清潔海水;硒化物組:20和40 mg/L硒代蛋氨酸、60和120 mg/L硒化卡拉膠、1和2 mg/L亞硒酸鈉;絡(luò)合劑組:80和160 mg/L EDTA、220和440 mg/L EDTA-FeNa、280和560 mg/L EDTA-ZnNa2、80和160 mg/L EDTA-CaNa2;金屬鹽組:120和240 mg/L FeCl2、160和320 mg/L FeCl3、80和160 mg/L ZnCl2;糖類(lèi)組:250和500 mg/Lβ-葡聚糖、100和200 mg/L肽聚糖、80和160 mg/L葡萄糖酸鈣。

1.3 實(shí)驗(yàn)測(cè)定與分析

1.3.1 Cd2+含量測(cè)定 將紫貽貝肉整體進(jìn)行8000 r/min勻漿2 min后,稱取0.800～1.200 g,加入HNO312.0 mL、HClO43.0 mL,混勻后消解。消解程序:升溫至100 ℃,保持30 min;至130 ℃,保持60 min;再升溫至150 ℃,至消解完成;最后升溫至180 ℃,趕酸至樣品容量約2 mL。冷卻至室溫,超純水定容50 mL,應(yīng)用島津AA-7000型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.27816x+0.08227,R2=0.9995)計(jì)算獲得Cd2+含量(濕重,μg/g)[6]。

1.3.2 脫除率計(jì)算 Cd2+脫除率(%)=[脫除前Cd2+含量(μg/g)-脫除后Cd2+含量(μg/g)]/脫除前Cd2+含量(μg/g)×100

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

以上實(shí)驗(yàn)及分析測(cè)定,至少3個(gè)平行樣品,計(jì)算平均值。數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0分析軟件,結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同硒化物對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響

硒元素(Se4+)在生物體內(nèi)具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性,是生物體內(nèi)重金屬元素的良好拮抗劑,能有效拮抗重金屬元素在體內(nèi)的積累[7]。但Se4+元素對(duì)機(jī)體的致毒濃度較低,如小鼠的亞硒酸鈉LD50為3.86 mg/kg(經(jīng)口),其安全限度空間較狹窄[8]。本研究比較了三種含硒化合物及其不同濃度對(duì)染毒紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)12 d凈化處理后,60 mg/L和120 mg/L硒化卡拉膠,表現(xiàn)出了顯著Cd2+的脫除效果(p<0.05),脫除率分別為43.6%和37.2%。此外,硒化卡拉膠對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+的脫除,均主要集中在0～6 d,第6 d的脫除率已達(dá)到37.9%和31.1%。此外,由于含Se4+化合物在生物體內(nèi)安全濃度范圍較狹窄,過(guò)多Se4+則可能會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性。

表1 不同硒化物對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響Table 1 Effect of different selenide on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

目前,關(guān)于Se4+拮抗Cd2+毒性作用機(jī)理未完全清楚,存在以下幾方面推理:Se4+的抗氧化作用;Se4+能清除Cd2+引發(fā)的氧自由基;體內(nèi)形成Se4+-Cd2+復(fù)合物;Se4+誘導(dǎo)體內(nèi)MT(金屬結(jié)合蛋白)的合成。Se4+及其化合物(如硒化氨基酸、硒化多糖)在機(jī)體內(nèi)具有顯著的清除自由基,并提高相關(guān)內(nèi)源保護(hù)酶活性等[9],并已在多種水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)得以證實(shí),如羅非魚(yú)[10]、凡納濱對(duì)蝦[11]等。而本實(shí)驗(yàn)中,亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸處理,對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+未表現(xiàn)出顯著的脫除作用(p>0.05)?？梢酝茢?Se4+可能通過(guò)抗氧化機(jī)制,在紫貽貝體內(nèi)發(fā)生Cd2+的拮抗或抵御攝入作用,但在本批次實(shí)驗(yàn)中未能使Cd2+有效的排出體外;此外,可以得出與Se4+結(jié)合的配體類(lèi)型對(duì)Cd2+的脫除也具有重要的影響。研究表明,相比于亞硒酸鈉和硒代蛋氨酸,硒化卡拉膠(κ型)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的體液免疫功能及抗氧化能力的提高作用顯著[12],其可為拮抗Cd2+毒性提供良好的體內(nèi)環(huán)境;與Se4+結(jié)合的配體類(lèi)型也可影響對(duì)Cd2+的脫除作用。此外,卡拉膠低聚糖具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性、聚集重金屬離子、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等多種生物功能[13]。因此,本實(shí)驗(yàn)中硒化卡拉膠表現(xiàn)出較好的Cd2+脫除作用,其原因可能來(lái)自多方面的協(xié)同效應(yīng),如Se4+的體內(nèi)抗氧化作用、卡拉膠低聚糖作為載體攜帶Se4+進(jìn)入機(jī)體而被吸收、卡拉膠低聚糖鰲合Cd2+及其免疫調(diào)節(jié)作用等方面的綜合作用。

2.2 不同金屬絡(luò)合劑對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響

EDTA是一種廣譜的金屬元素絡(luò)合劑,常用于改善水生生物培養(yǎng)及育苗水體的水質(zhì)質(zhì)量[14]。部分研究指出,EDTA對(duì)水產(chǎn)品體內(nèi)重金屬脫除具有一定的作用。EDTA及其金屬化合物種類(lèi)較多,本研究比較了常見(jiàn)EDTA類(lèi)絡(luò)合物對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響(表2)。結(jié)果表明,凈化12 d后,EDTA和EDTA-CaNa2對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+脫除效果顯著(p<0.05),二者低濃度組脫除率為30.4%和21.3%,高濃度脫除率分別為24.6%和41.6%。實(shí)驗(yàn)中,較低濃度EDTA對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+凈化效果較好,其原因可能是由于EDTA濃度過(guò)高時(shí),螯合了紫貽貝體內(nèi)大量生長(zhǎng)所需的必需金屬離子,而使紫貽貝生理活力降低、Cd2+脫出量較少。此外,160 mg/L EDTA-CaNa2凈化效果最佳,其Cd2+脫除率顯著高于其他各組(p<0.05)。在整個(gè)凈化實(shí)驗(yàn)期內(nèi),EDTA-FeNa和EDTA-ZnNa2未表現(xiàn)出顯著Cd2+脫出效果(p>0.05)。

表2 不同EDTA絡(luò)合劑對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響Table 2 Effect of different EDTA compounds on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

目前,在臨床上我國(guó)使用小劑量EDTA-CaNa2作為兒童鉛中毒的治療方案[15],還有應(yīng)用EDTA對(duì)尿鎘超標(biāo)者進(jìn)行驅(qū)鎘效果的研究報(bào)道[16]。Hiraoka等[17]在人工海水中添加0.5% EDTA(w/v),48 h后發(fā)現(xiàn)EDTA可有效脫除暫養(yǎng)牡蠣體內(nèi)的Cd2+和Cu2+含量。但Das等[18]報(bào)道了相反的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)添加EDTA對(duì)貝類(lèi)Cd2+含量無(wú)顯著影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加傾向于Hiraoka等報(bào)道結(jié)果,其原因可能主要來(lái)自于EDTA的金屬元素絡(luò)合作用。此外,另有研究表明,雙殼貝類(lèi)中Cd2+通過(guò)Ca2+通道吸收并轉(zhuǎn)運(yùn),在暫養(yǎng)水體中添加Ca2+以競(jìng)爭(zhēng)Ca2+通道,或者添加Ca2+通道抑制劑,均可顯著抑制Cd2+的富集,加速其排出[19]。

本研究中,EDTA-CaNa2表現(xiàn)出較好的Cd2+凈化效果,而EDTA-FeNa、EDTA-ZnNa2無(wú)顯著性效果,其部分原因可能來(lái)自于Ca2+在紫貽貝體內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)性作用。但仍需要指出的是,EDTA絡(luò)合物具有較強(qiáng)的金屬元素絡(luò)合作用,其對(duì)紫貽貝體內(nèi)其他金屬元素含量的影響及安全性評(píng)價(jià),還需進(jìn)一步研究探討。

2.3 不同金屬鹽對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響

本部分實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)玫投拘澡F、鋅化合物處理暫養(yǎng)紫貽貝,以期評(píng)價(jià)其對(duì)紫貽貝體內(nèi)重金屬含量的影響。結(jié)果見(jiàn)表3，由表可知,FeCl2、FeCl3及低濃度的ZnCl2對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+均未表現(xiàn)出顯著的凈化脫除效果;僅當(dāng)ZnCl2濃度較高時(shí)(160 mg/L),經(jīng)12 d凈化期后,紫貽貝體內(nèi)Cd2+脫除率為17.6%,其脫除效果主要表現(xiàn)在6～12 d,凈化處理時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。鋅元素(Zn2+)作為生物體的必需元素,是維持機(jī)體諸多蛋白質(zhì)正常結(jié)構(gòu)和生物功能的重要組成部分。在水環(huán)境中,Zn2+和Cd2+往往是共存的,由于Zn2+和Cd2+化學(xué)性質(zhì)相似,因此二者之間易于產(chǎn)生相互作用。柴茜等[20]研究發(fā)現(xiàn),在一定條件下,Zn2+對(duì)Cd2+引起的河南華溪蟹的氧化損傷作用,具有明顯的抑制作用;Zn2+對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用與其促進(jìn)抗氧化酶SOD、CAT的合成有關(guān),并通過(guò)誘導(dǎo)MT的合成來(lái)實(shí)現(xiàn);對(duì)于生物活性部分中的Cd2+,較高濃度Zn2+能促進(jìn)Cd2+的有效排出。本研究結(jié)果,與柴茜等報(bào)道結(jié)果相一致。

表3 不同金屬鹽對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響Table 3 Effect of different metal compounds on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

2.4 不同糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響

β-葡聚糖、肽聚糖等作為常見(jiàn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫增強(qiáng)劑,已證實(shí)其對(duì)魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)等[21-22]具有顯著的提高生長(zhǎng)性能、存活及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等活性。本部分研究,探索不同糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響,如表4所示。結(jié)果表明,500 mg/Lβ-葡聚糖、80 mg/L和160 mg/L葡萄糖酸鈣對(duì)Cd2+凈化效果顯著(p<0.05),Cd2+脫除率依次為44.6%,17.2%和28.0%,且在0～6 d凈化期內(nèi)脫除效果較好,而隨著脫除時(shí)間延長(zhǎng),紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量基本保持平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)中,肽聚糖對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+凈化脫除無(wú)明顯效果。

表4 不同糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量的影響Table 4 Effect of different saccharides on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

β-葡聚糖由β-1,3-D-吡喃型葡萄糖聚合而成,具有抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能[23],其功能機(jī)制主要是以激活免疫細(xì)胞,促進(jìn)抗體的產(chǎn)生為主,從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能[24]。本實(shí)驗(yàn)中,β-葡聚糖對(duì)紫貽貝表現(xiàn)出較好的Cd2+凈化效果,但其應(yīng)用劑量較大;也有研究指出,β-葡聚糖還存在著免疫調(diào)節(jié)時(shí)間短、會(huì)出現(xiàn)“免疫疲勞”等問(wèn)題[25],因此,單獨(dú)的β-葡聚糖進(jìn)行水產(chǎn)動(dòng)物Cd2+凈化,應(yīng)用成本較高,不適合推廣應(yīng)用。另一方面,葡萄糖酸鈣作為一種營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑,已用于多種人體排鉛口服液中的主要成分,起到一定的重金屬排出效果。朱連勤等[26]向小鼠染毒飼料中添加葡萄糖酸鈣,評(píng)價(jià)了葡萄糖酸鈣對(duì)小鼠鉛中毒的影響作用,結(jié)果顯示葡萄糖酸鈣可提高小鼠抗氧化酶活性、顯著降低了鉛對(duì)機(jī)體的毒性作用。本研究結(jié)果符合以上文獻(xiàn)報(bào)道及應(yīng)用效果。此外,由于葡萄糖酸所攜帶的Ca2+對(duì)紫貽貝機(jī)體內(nèi)Cd2+的凈化排出,也可能起到一定的積極作用。

3 結(jié)論

凈水暫養(yǎng)法脫除貝類(lèi)體內(nèi)的重金屬,存在周期長(zhǎng)、損耗大且會(huì)再次污染暫養(yǎng)水域等弊端,因此探索不同的貝類(lèi)重金屬脫除方法,對(duì)保障貝類(lèi)食品安全具有重要意義。本研究比較了不同的硒類(lèi)化合物、EDTA類(lèi)絡(luò)合物、金屬鹽類(lèi)及糖類(lèi)物質(zhì)等對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+含量影響情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)12 d的脫除,60和120 mg/L硒化卡拉膠、80和160 mg/L EDTA及EDTA-CaNa2、160 mg/L氯化鋅、500 mg/Lβ-葡聚糖、80和160 mg/L葡萄糖酸鈣凈化處理,對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+具有顯著脫除效果,其脫除率分別為43.6%、37.2%、30.4%、24.6%、21.3%、41.6%、17.6%、44.6%、17.2%和28.0%,其中,脫除效果最優(yōu)的為500 mg/Lβ-葡聚糖,其脫除率為44.6%。但紫貽貝體內(nèi)Cd2+凈化機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。研究?jī)?nèi)容將為今后繼續(xù)研究脫除水產(chǎn)動(dòng)物中重金屬殘留,開(kāi)發(fā)具有脫除重金屬作用的飼料添加劑及魚(yú)、貝類(lèi)凈化或暫養(yǎng)脫重金屬專(zhuān)用劑等提供借鑒作用。

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