檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性及其機(jī)理

劉 雪,王靜楠,陳文學(xué),陳榮豪,張觀飛

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228)

檸檬烯,又稱苧烯,學(xué)名為 1-甲基-4-異丙基環(huán)己烯,分子式為C10H16,是一種環(huán)己酮單萜,常溫下是一種無色油狀液體[1-2]。天然檸檬烯存在3種異構(gòu)體形式,包括D、L和DL構(gòu)型,其中最常見的是D-檸檬烯[3]。由于其透明度和令人愉快的柑橘香味,檸檬烯在食品和飲料行業(yè)通常被用作添加劑[4]。在國(guó)外,美國(guó)食用香料與提取物制造商協(xié)會(huì)認(rèn)定其毒性屬于GRAS(一般公認(rèn)安全)級(jí),FAO和WHO對(duì)D-檸檬烯的ADI(每日容許攝入量)也不進(jìn)行特殊規(guī)定[5-6]。在國(guó)內(nèi),GB2760-2011食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定D-檸檬烯為允許使用的香料[3]。

檸檬烯是很多植物油如檸檬油、柑橘油、橙皮油等的主要成分,在胡椒油中含量也比較豐富[2]。徐可文等通過氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測(cè)得黑胡椒揮發(fā)油中D-檸檬烯的含量在12.32%～20.35%之間,也有研究表明胡椒提取物中含有萜烯類物質(zhì),包括檸檬烯[7-8]。目前,國(guó)內(nèi)外研究表明檸檬烯具有抑菌作用。LIS-BALCHIN等人[9]研究了(+)-檸檬烯和(-)-檸檬烯在體外對(duì)25種不同的革蘭氏菌以及20種單核細(xì)胞增生李斯特菌的抗菌活性,結(jié)果表明二者都具有抑菌性。SINGH等[10-11]發(fā)現(xiàn)檸檬烯對(duì)青霉、綠霉和黃曲霉均具有較好的抑制性。王雪梅等人[12]的研究表明檸檬烯具有廣譜抗菌性。

近年來,由食源性致病菌引起的食源性疾病頻發(fā),對(duì)整個(gè)社會(huì)的食品安全和公共安全造成了重大威脅[13]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),又稱綠膿桿菌,是一種食源性致病菌,也是常見的條件致病菌,會(huì)引起食源性疾病包括食物中毒、腸道傳染病等[14]。研究表明,檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌存在抑菌效果[15],然而關(guān)于檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理尚未見有報(bào)道。本研究通過測(cè)定檸檬烯的最小抑菌濃度(MIC)及細(xì)菌生長(zhǎng)曲線等指標(biāo),探討檸檬烯的抑菌活性,進(jìn)一步揭示檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理,為檸檬烯應(yīng)用于食品的保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(+)-檸檬烯(>95.0%) 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社(TCI);銅綠假單胞菌(ATCC 9027) 廣東省微生物菌種保藏中心;牛肉膏、瓊脂、蛋白胨、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS) 北京索萊寶科技有限公司;氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 廣州化學(xué)試劑廠;羅丹明123 上海源葉生物科技有限公司。

高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;無菌超凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;SPX生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;SHA-2恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;F-280熒光分光光度計(jì) 天津港東科技發(fā)展股份有限公司;艾本德 5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司;DDS-307電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;S-3000掃描式電子顯微鏡 日本日立公司;電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將銅綠假單胞菌在營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基中傳代活化后保存?zhèn)溆?采用麥?zhǔn)媳葷岱╗16],將銅綠假單胞菌置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,用生理鹽水(0.9% NaCl)將培養(yǎng)后的細(xì)菌從斜面上洗脫下來,并將菌懸液的濃度稀釋至含菌量約為106～107cfu/mL。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用肉湯稀釋法[17],根據(jù)黃聰亮、潘旭遲[18-19]的方法做適當(dāng)調(diào)整,用70%乙醇溶解檸檬烯,并將其二倍梯度稀釋成200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mL/L的抑制液,在平板中加入上述配制好的2 mL抑制液,與18 mL降溫至50 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基混合均勻,使其終濃度分別為20.0000、10.0000、5.0000、2.5000、1.2500、0.6250、0.3125 mL/L。待培養(yǎng)基凝固后取0.2 mL濃度約為107cfu/mL的供試菌懸液于平板上涂布均勻。以無菌水和70%乙醇作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,將各平板于37 ℃中倒置培養(yǎng)24 h。觀察,以完全不長(zhǎng)菌的最小稀釋濃度確定為檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌作用的MIC。

1.2.3 細(xì)菌生長(zhǎng)的測(cè)定 采用干重法,使用無菌生理鹽水(0.9%)將銅綠假單胞菌梯度稀釋至106～107cfu/mL,將菌懸液按照1%(v/v)的接種量接種到液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h后,加入檸檬烯使其終濃度為1 MIC、2 MIC,每隔1 h取樣,先置于預(yù)先烘干并稱重的離心管中8000 r/min離心,棄上層菌液,然后用無菌水重懸洗滌,將菌體置于80 ℃下烘干至恒重后,測(cè)得菌體干重。以無菌水作為對(duì)照組。

1.2.4 掃描電鏡(SEM) 根據(jù)Diao Wen-Rui等人[20]的方法做適當(dāng)調(diào)整,對(duì)所測(cè)試的細(xì)菌進(jìn)行SEM觀察。供試菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,分別加入1 MIC和2 MIC濃度的檸檬烯,以無菌水和70%乙醇作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照,將各組菌懸液37 ℃搖床培養(yǎng),取培養(yǎng)4、16 h的菌懸液,6000 r/min離心10 min收集菌體。先用0.1 mol/L PBS洗滌3次,再分別用濃度為20%、40%、60%、80%乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水,每個(gè)濃度洗脫2次,最后用無水乙醇洗脫3次。將脫水后的樣品在-20 ℃條件下預(yù)凍,再使用真空冷凍干燥器冷凍干燥12 h。取出干燥完全的樣品、上樣、通過陰極噴涂將樣品金覆蓋,在掃描電子顯微鏡上觀察供試菌放大8000倍的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 菌液電導(dǎo)率的測(cè)定 根據(jù)張新虎[21]等的方法做適當(dāng)調(diào)整,將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的銅綠假單胞菌用無菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)洗滌3次,取菌液與檸檬烯溶液混合,使其終濃度為1 MIC、2 MIC,用70%乙醇替代檸檬烯溶液作為對(duì)照組,每隔10 min測(cè)定1次電導(dǎo)率,連續(xù)2 h。

1.2.6 膜電位的測(cè)定 根據(jù)Zhang Yunbin[22]的方法做適當(dāng)調(diào)整,采用羅丹明123熒光染色法測(cè)定膜電位。供試菌在液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h,調(diào)整菌液濃度約為106～107cfu/mL。分別加入1 MIC和2 MIC濃度的檸檬烯,以無菌水和70%乙醇作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照,150 r/min振搖培養(yǎng)3 h后離心棄上清再用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗2次。將羅丹明123用無菌磷酸鹽緩沖液溶解,配制成濃度為1 mg/mL的母液,加入菌液中使其終濃度為2 μg/mL,避光孵育30 min。菌液用無菌磷酸鹽緩沖液充分洗凈、重懸。轉(zhuǎn)移到石英比色皿中,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定平均熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm,狹縫寬度為10 nm,該數(shù)據(jù)用平均熒光強(qiáng)度表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS的單因素方差分析進(jìn)行差異性分析(p<0.05),并使用Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬烯的最小抑菌濃度

最小抑菌濃度(MIC)是衡量物質(zhì)抑菌能力的標(biāo)準(zhǔn)之一[23]。檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌的MIC見表1。

表1 檸檬烯的最小抑菌濃度(MIC)Table 1 MIC of limonene on bacteria

表1可知,檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌存在較強(qiáng)的抑菌作用,MIC為10 mL/L,而且隨著檸檬烯濃度的提高,其抑菌能力也在增強(qiáng)。同時(shí),無菌水和乙醇組均有菌生長(zhǎng),說明其不能對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)生抑制作用。潘旭遲[19]等研究發(fā)現(xiàn)檸檬烯作為檸檬油的有效抑菌成分,其標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為6.25 μg/mL,抑制作用較強(qiáng)。

2.2 檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的影響

微生物生長(zhǎng)曲線是反映微生物數(shù)量(活細(xì)菌個(gè)數(shù)或細(xì)菌重量)隨培養(yǎng)時(shí)間變化的曲線,測(cè)定方法包括比濁法、干重法、血球板計(jì)數(shù)法和平板菌落計(jì)數(shù)法[24]。檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的影響見圖1。

圖1 檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of limonene on the growth of P. aeruginosa

由圖1可見,對(duì)照組的菌體干重隨著培養(yǎng)時(shí)間增加不斷提高,在前11 h里持續(xù)上升至1.0,細(xì)菌不斷增殖,生長(zhǎng)速度快,11～12 h期間保持穩(wěn)定,可能是細(xì)菌生長(zhǎng)已達(dá)到穩(wěn)定期,新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等,新細(xì)胞使干重增加,而老細(xì)胞死亡后發(fā)生自溶減少干重,所以干重保持相對(duì)穩(wěn)定。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組,當(dāng)銅綠假單胞菌經(jīng)過1 MIC和 2 MIC檸檬烯處理后,其生長(zhǎng)曲線發(fā)生明顯變化,菌體干重隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)圍繞0.2上下波動(dòng),在8 h后逐漸平穩(wěn)并在11 h發(fā)生下降,并且均顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。2 MIC組與1 MIC組相比,前者的菌體干重小于后者,說明檸檬烯濃度的提高會(huì)使銅綠假單胞菌生長(zhǎng)受到更強(qiáng)的抑制,即抑制程度2 MIC>1 MIC。實(shí)驗(yàn)表明,檸檬烯能夠顯著抑制銅綠假單胞菌的正常生長(zhǎng),抑制其細(xì)胞增殖速度,從而發(fā)揮抑菌作用。

2.3 銅綠假單胞菌的掃描電鏡

為了進(jìn)一步確認(rèn)檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌作用方式,進(jìn)行掃描電鏡分析[25],見圖2。

圖2 銅綠假單胞菌的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microphotographs of P. aeruginosa注:A1、B1、C1、D1:4 h處理后的空白組、對(duì)照組、1MIC組、2MIC組;A2、B2、C2、D2:16 h處理后的空白組、對(duì)照組、1MIC組、2MIC組。

通過圖中A1、A2能夠看出,不添加抑菌物質(zhì)的銅綠假單胞菌菌體外表光滑,呈桿狀分布,結(jié)構(gòu)規(guī)則完整,無褶皺變形。如圖B1、B2所示,添加乙醇的陰性對(duì)照組處理4 h后,供試菌形態(tài)無明顯變化,處理16 h后,部分菌體發(fā)生凹陷。根據(jù)圖C1、D1,添加1 MIC和2 MIC的檸檬烯作用4 h后,銅綠假單胞菌小部分出現(xiàn)空洞干癟,同時(shí)有細(xì)胞堆疊、粘結(jié)。作用16 h后,由圖C2、D2所示,菌體變化明顯,細(xì)胞形態(tài)已遭到嚴(yán)重破壞,絕大部分菌體發(fā)生萎陷,出現(xiàn)空洞,表面粗糙不平整,同時(shí)部分菌體變短,有細(xì)胞斷裂現(xiàn)象,難以發(fā)現(xiàn)形態(tài)正常的菌體。而且,添加2 MIC檸檬烯的菌體與1 MIC相比受破壞程度更嚴(yán)重,斷裂和存在孔洞的菌體更多。說明檸檬烯可以抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng),改變細(xì)胞原有的正常形態(tài),破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,最終導(dǎo)致其死亡。Di Pasqua等[26]人通過掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌和假單胞菌屬菌株經(jīng)檸檬烯作用后,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,菌體出現(xiàn)粘結(jié)、腫脹,甚至裂解,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似。

2.4 檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌電導(dǎo)率的影響

在細(xì)菌受到強(qiáng)抑菌物質(zhì)的作用時(shí),菌體的細(xì)胞膜遭到破壞,失去原有保護(hù)能力,細(xì)胞內(nèi)有帶電離子等溶出,內(nèi)部電解質(zhì)向外泄露到培養(yǎng)液中,導(dǎo)致培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加。因此,細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化可以通過菌液電導(dǎo)率值的變化來反映[27]。

由圖3可知,對(duì)照組的電導(dǎo)率在前40 min內(nèi)持續(xù)增加,40～110 min時(shí)相對(duì)平穩(wěn),可能是因?yàn)榧?xì)胞的正常裂解和死亡,導(dǎo)致其電導(dǎo)率上升。當(dāng)檸檬烯濃度為1 MIC和2 MIC時(shí),隨著時(shí)間的增加,銅綠假單胞菌菌液的電導(dǎo)率均高于對(duì)照組,同時(shí),其電導(dǎo)率總體呈上升趨勢(shì)。這意味著細(xì)胞膜的滲透性增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分的滲漏,特別是電解質(zhì)的損失,包括K+、Ca2+、Na+。對(duì)實(shí)驗(yàn)組來說,添加1 MIC和2 MIC的菌液電導(dǎo)率曲線在時(shí)間變化過程中出現(xiàn)交叉、重合,二者的電導(dǎo)率值在大部分時(shí)間點(diǎn)不存在顯著差異(p>0.05),原因可能是達(dá)到1 MIC濃度的檸檬烯已經(jīng)對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行了充分的破壞,使電解質(zhì)大量外滲,2 MIC從數(shù)值上在前期略有增加但無顯著差異。結(jié)果表明,檸檬烯能夠提高銅綠假單胞菌細(xì)胞膜的通透性,破壞細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)定性,從而發(fā)揮抑菌作用。王亞麗[28]等的研究也顯示,藍(lán)莓葉多酚能夠增加銅綠假單胞菌細(xì)胞膜的通透性,反映出抑菌性。

圖3 檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌電導(dǎo)率的影響Fig.3 Changes in electric conductivity of broth for P. aeruginosa by limonene

2.5 檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌膜電位的影響

檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌膜電位的影響如圖4所示,未添加檸檬烯的菌液中銅綠假單胞菌的平均熒光強(qiáng)度為386.38 AU,當(dāng)添加1 MIC、2 MIC濃度的檸檬烯后,銅綠假單胞菌的平均熒光強(qiáng)度分別為140.23 AU和11.50 AU,與對(duì)照組相比分別降低了63.73%和97.02%,二者與對(duì)照組相比,均存在極顯著差異(p<0.01)。同時(shí)2 MIC組在1 MIC組的基礎(chǔ)上下降了91.80%,表明檸檬烯濃度的增加會(huì)使銅綠假單胞菌的平均熒光強(qiáng)度顯著降低(p<0.01)。

圖4 檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌膜電位的影響Fig.4 Effect of limonene on the membrane potential(MP)of P. aeruginosa

膜電位是指生物細(xì)胞膜內(nèi)部和外部之間存在的電勢(shì)差,典型的例子是線粒體膜電位,維持正常的線粒體膜電位是保持線粒體氧化磷酸化水平和產(chǎn)生ATP以維持細(xì)胞功能的前提[29]。羅丹明123是一種親脂性陽(yáng)離子染料,憑借跨膜電位進(jìn)入到細(xì)胞基質(zhì)中,其熒光強(qiáng)度的大小可反映膜電位的變化[30]。對(duì)于正常的細(xì)菌來說,通常膜內(nèi)的電壓比膜外的低。如果膜電位降低,則說明細(xì)胞發(fā)生了去極化現(xiàn)象,反之,如果升高說明發(fā)生了超極化現(xiàn)象[31]。本實(shí)驗(yàn)表明,檸檬烯的添加導(dǎo)致銅綠假單胞菌膜電位降低,引起了細(xì)胞的去極化,影響細(xì)胞的正常代謝活動(dòng),進(jìn)而抑制其生長(zhǎng),導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

3 結(jié)論

本研究通過測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)評(píng)估了檸檬烯的抑菌活性,通過測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、掃描電鏡觀察形態(tài)、測(cè)定細(xì)胞膜通透性以及膜電位揭示了檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明:檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌具有抑制作用,抑菌活性較強(qiáng);檸檬烯抑制了銅綠假單胞菌的生長(zhǎng),其細(xì)胞膜原有完整結(jié)構(gòu)遭到破壞;在檸檬烯作用下,銅綠假單胞菌細(xì)胞膜通透性增大,內(nèi)部電解質(zhì)溶出,菌液的電導(dǎo)率不斷增加;細(xì)胞膜電位降低,熒光喪失,細(xì)胞發(fā)生去極化導(dǎo)致不規(guī)則的細(xì)胞代謝活動(dòng),引發(fā)銅綠假單胞菌走向死亡。檸檬烯是許多精油的主要組成部分,尤其是黑胡椒油的主要活性成分,本研究初步探究檸檬烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理,也為胡椒中檸檬烯和其他活性成分進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

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