高效液相法測定清瘟解毒口服液中連翹苷的含量

楊修鎮(zhèn) 張呈軍 陳 玲

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250022）

清瘟解毒口服液收載于《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)匯編－獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》第二冊，具有清熱解毒的功效，臨床用于雞外感發(fā)熱的治療[1]，具有見效快，無藥殘，重復(fù)使用不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。清瘟解毒口服液的國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均為定性鑒別，缺乏該方劑主要藥效成分的定量檢測，這不利于產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的控制，可能導(dǎo)致產(chǎn)品臨床療效的較大差異。方中連翹在治療時起關(guān)鍵性作用[2]，為了更好的控制本品質(zhì)量，本試驗(yàn)對清瘟解毒口服液中連翹苷的含量測定方法進(jìn)行了研究。

1 儀器和材料

Agilent1200高效液相色譜儀，連翹苷對照品，批號110821-201213，含量：95.3%，購自中國食品藥品檢定研究院。清瘟解毒口服液，批號201204001、201204002、201204003山東華爾康獸藥有限公司提供，批號20130101、20130102、20130103山東廣元藥業(yè)有限公司提供，批號13031401、13031402、13031403山東派森藥業(yè)有限公司提供，批號130610煙臺綠葉動物保健品有限公司提供。乙腈為色譜純，流動相用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件

色譜柱為C18(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為乙腈－水(19：81)，檢測波長為278nm，流速1ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μl。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取連翹苷對照品60mg置100ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得600μg/ml的連翹苷對照品貯備液。精密量取上述連翹苷對照品貯備液5ml，置50ml量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得60μg/ml的連翹苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備[3]

精密量取清瘟解毒口服液3ml，加在中性氧化鋁柱(100～200目，6g，內(nèi)徑為1cm)上，用70%乙醇40ml洗脫，收集流出液和洗脫液，濃縮至干，殘渣加50%甲醇適量，溫?zé)崾谷芙?，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 空白樣品溶液制備

按清瘟解毒口服液標(biāo)準(zhǔn)制法項(xiàng)制備不含連翹的口服液并按供試品溶液制備方法制備空白樣品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果表明空白樣品無干擾，連翹苷分離良好，結(jié)果見圖1～3。

圖1 連翹苷對照品HPLC色譜圖

圖2 清瘟解毒口服液樣品HPLC圖譜

圖3 空白樣品HPLC色譜圖

2.6 線性范圍考察[4]

精密量取連翹苷對照品貯備液，用80%甲醇稀釋成15、30、60、120、240、480μg/ml的系列溶液，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/ml)，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為：y=5.3184x＋2.3155(r=0.9999)，結(jié)果表明。連翹苷進(jìn)樣濃度在12～480μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 儀器精密度試驗(yàn) 精密量取60μg/ml的連翹苷對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定，峰面積RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密量清瘟解毒口服液3ml，按供試品溶液制備項(xiàng)制備樣品溶液，制備6份，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果表明連翹苷含量RSD為0.5%，重復(fù)性良好。

2.7.3 中間精密度試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)室同一分析人員在不同日期測定同一批清溫解毒口服液，以及不同分析人員使用不同設(shè)備測定同一批清溫解毒口服液，結(jié)果表明連翹苷含量相對相差在1.5%以內(nèi)。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別精密量取已知含量清溫解毒口服液2ml與濃度為240 μg/ml的連翹苷對照品溶液1ml，加在中性氧化鋁柱(100～200目，6g，內(nèi)徑為1cm)上，自“用70%乙醇40ml洗脫”起按供試品溶液制備項(xiàng)制備樣品溶液，平行6份，注入液相色譜儀，計算連翹苷回收率，平均回收率為95.5%，RSD為0.9%，結(jié)果見表1。

2.9 耐用性試驗(yàn)

2.9.1 被測溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取清溫解毒口服液(批號201204001)3ml，按供試品溶液制備項(xiàng)制備樣品溶液，于制備后0、1、2、4、8、16、24、48 h分別進(jìn)樣測定連翹苷峰面積，結(jié)果表明RSD為0.4%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9.2 流動相組成的微小波動 乙腈－水(18：82)和(20：80)；不同廠家的同類型色譜柱；柱溫的微小變動(22℃、28℃)；流速的微小變動(0.9ml/min、1.1ml/min)及檢測波長的微小變動(276nm、280nm)對連翹苷的分離效果無明顯影響。

2.10 樣品含量測定 分別取不同批號清瘟解毒口服液，按供試品溶液制備項(xiàng)制備樣品溶液，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定，每份樣品測定2次，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 小結(jié)

（1）檢測波長選擇：取連翹苷對照品適量，用50%甲醇溶解并稀釋成300μg/ml的溶液，在200～400nm波長進(jìn)行掃描，結(jié)果在278nm有最大吸收，因此選擇278nm作為檢測波長。（2）在本研究中，參考《中國獸藥典》連翹[5]項(xiàng)下內(nèi)容和雙黃連口服液項(xiàng)下內(nèi)容，對樣品進(jìn)行前處理，采用連翹項(xiàng)下前處理方式回收率偏低，故采用雙黃連口服液項(xiàng)下前處理方式。

本文建立的HPLC法測定清瘟解毒口服液中連翹苷的含量，空白樣品無干擾，方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，能為進(jìn)一步控制清瘟解毒口服液的質(zhì)量提供依據(jù)。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

[1]農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心.獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)匯編[S].獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)(第2冊). 83-84.

[2]王海新.清瘟解毒口服液在治療傳染性喉氣管炎中的體會[J].獸藥市場指南,2014(5)： 45-45.

[3]中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S].2010年版二部,580-581.

[4]張曉慧，建學(xué). HPLC法測定不同產(chǎn)地連翹中連翹苷含量[J].中國釀造，2008，13(1)： 78-79.

[5]中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S].2010年版二部, 231-232.