玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體全基因組序列測(cè)定與分析

孫志鵬，呂偉華，匡友誼，鄭先虎，佟廣香，孫效文，程磊，何立川，曹頂臣，吳學(xué)農(nóng)

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

玻璃缺鰭鯰（玻璃貓魚(yú)）Kryptopterus vitreolus屬鯰科、缺鰭鯰屬，主要分布于泰國(guó)、馬來(lái)西亞和印度尼西亞，體長(zhǎng)一般12～18cm，是一種常見(jiàn)的觀(guān)賞魚(yú)。玻璃缺鰭鯰全身無(wú)鱗，缺乏色素，游泳時(shí)看上去像一副魚(yú)類(lèi)骨骼在飄動(dòng)，因此又稱(chēng)為“幽靈魚(yú)”。魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組（Mitochondrial DNA，mtDNA）與其他脊椎動(dòng)物相似，是閉合雙鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度一般在15.7～19.5kb，由37個(gè)編碼基因、輕鏈復(fù)制起始區(qū)（OL）、主要的控制區(qū)（CR）及散布于不同基因間的非編碼序列組成。mtDNA作為細(xì)胞核外具有自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯能力的遺傳因子，相比于核DNA，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、拷貝數(shù)多、母系遺傳、進(jìn)化速度快、不同區(qū)域進(jìn)化速率不同，而且易于擴(kuò)增測(cè)序?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，線(xiàn)粒體基因已作為分子標(biāo)記應(yīng)用到魚(yú)類(lèi)的物種鑒別、分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育等研究領(lǐng)域中[1-6]。

缺鰭鲇屬分類(lèi)較為混亂，相關(guān)研究較少，直至2013年玻璃缺鰭鯰才被正式定種。路斌等[7]在西雙版納羅梭江魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了湄南缺鰭鲇Kryptopterus moorei；楊光等[8]對(duì)8種鯰科魚(yú)類(lèi)的ITS序列與18s序列的研究中報(bào)道，雙須缺鰭鲇Kryptopterus bicirrhis18s序列為 1 833bp，ITS1序列為408bp，ITS2序列為339bp。本研究測(cè)定了玻璃缺鰭鯰全線(xiàn)粒體基因組，對(duì)豐富缺鰭鲇屬基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)進(jìn)化研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

30尾玻璃缺鰭鯰購(gòu)自哈爾濱四平觀(guān)賞魚(yú)公司，現(xiàn)有24尾養(yǎng)殖于黑龍江水產(chǎn)研究所斑馬魚(yú)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取玻璃缺鰭鯰尾部肌肉，采用Sambrook等[9]的方法和酚-氯仿提取總DNA，用Nanodrop 8000及1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA核酸含量和質(zhì)量。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR的擴(kuò)增

利用已發(fā)表的瓦氏黃顙魚(yú)Pelteobagrus vachelli[6]16對(duì)線(xiàn)粒體基因組擴(kuò)增引物對(duì)玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中6對(duì)（P.V3、P.V5、P.V8、P.V9、P.V13和 P.V15本實(shí)驗(yàn)中分別編號(hào)為KV.2、KV.4、KV.6、KV.7、KV.11 和 KV.13）可以擴(kuò)增得到目的片段。利用NCBI比對(duì)測(cè)序得到的序列與南方鲇Silurus meridionalis相似度最高。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用Primer 3再設(shè)計(jì)9對(duì)引物（KV.1、KV.3、KV.5、KV.8、KV.9、KV.10、KV.12、KV.14 和 KV.15）。15對(duì)引物見(jiàn)表1。

表1 玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體基因組擴(kuò)增引物Tab.1 Mitochondrial genome amplification primers of catfish Kryptopterus vitreolus

PCR反應(yīng)體系為50μL，包括10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，上下游引物（10μmol/L）各 2μL，Taq DNA 聚合酶 3U，DNA 模板（50ng/μL）6μL，補(bǔ)無(wú)菌水到50μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性 3min；94℃變性30s，52～62℃復(fù)性 30s，72℃延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃保存。

1.2.3 測(cè)序與序列拼接

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒（康為世紀(jì)）純化，純化產(chǎn)物連接到pMD18-T（TaKaRa）載體（反應(yīng)體系及反應(yīng)時(shí)間按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行克隆，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。由DNAMAN分析測(cè)序結(jié)果，用Staden（1.7）進(jìn)行序列拼接。

1.2.4 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

表2 玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體基因組結(jié)構(gòu)Tab.2 Organization of the mitochondrial genome of catfish K.vitreolus

拼接得到線(xiàn)粒體全基因組序列，DNAMAN統(tǒng)計(jì)序列全長(zhǎng)、堿基百分比等信息，利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)工具 Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析序列同源性，結(jié)合 tRNA Scan-SE 1.21（http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）定位tRNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因和D-loop區(qū)，以確定玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體基因組的基因結(jié)構(gòu)。

查找GenBank中脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體核苷酸序列，使用Clustal W軟件對(duì)5種魚(yú)類(lèi)全序列及13個(gè)編碼蛋白基因的核苷酸序列分別進(jìn)行比對(duì)分析。基于5個(gè)科12種魚(yú)與2個(gè)外群的線(xiàn)粒體D-loop區(qū)核苷酸序列，由Modeltes選擇最適模型，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootsrap值1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組結(jié)構(gòu)

玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體基因組全長(zhǎng)16 662bp（Genbank accession number，KY710750），包括 2 個(gè) rRNA基因、22個(gè)tRNA基因、13個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因和一個(gè)非編碼控制區(qū)。玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體基因組結(jié)構(gòu)和基因排列順序與已公布的鲇形目魚(yú)類(lèi)完全一致。其中 ND6、tRNA-Pro、tRNA-Glu、tRNA-Ser、tRNA-Alu、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr和 tRNA-Gln 在 L鏈外其他大多數(shù)基因在H鏈編碼（表2）。

A、T、C和 G四種堿基組成分別為：30.54%、26.34%、27.76%和15.36%，其中A+T含量（56.88%）明顯高于G+C含量（43.12%）?；蚪M共包含9個(gè)基因間隔區(qū)，間隔長(zhǎng)度1～34bp，最大間隔在tRNA-Asn和tRNA-Cys基因之間；基因間共存在12處重疊，重疊堿基數(shù)1～10bp，最長(zhǎng)的重疊區(qū)位于ATP6和COX3基因。玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體全基因組中除COX1以GTG為起始密碼子外，其余12個(gè)編碼蛋白的基因都以ATG開(kāi)頭。7個(gè)編碼蛋白基因（ND1、Cox1、ATP8、ATP6、ND4L、ND5 和 ND6） 以TAA終止，其余6個(gè)編碼蛋白的基因沒(méi)有完整的終止密碼子，包括Cox2、ND3和ND4以T終止，ND2、Cox3和CYTB以TA終止。

2.2 控制區(qū)（D-LOOP）結(jié)構(gòu)

魚(yú)類(lèi)mtDNA D-loop區(qū)一般分為三個(gè)部分：終止序列區(qū)（termination associated sequences，TAS）、中央保守區(qū)（central conserved sequence block，CSB）和保守序列區(qū)（conserved sequence block，CSB）。參考其他魚(yú)類(lèi)控制區(qū)分析結(jié)果[10]推測(cè)出，本實(shí)驗(yàn)得到的玻璃缺鰭鯰的線(xiàn)粒體控制區(qū)結(jié)構(gòu)包括：潛在終止區(qū)域（ETAS）位于 15 712～15 733bp，5個(gè)保守區(qū)域分別為CSB-1（16269～16288bp）、CBS-2（16377～16394bp）、CBS-3（16 402～16 420）、CBS-D（16 023～16 050bp）和 CBS-E（15 982～16 007 bp）。保守區(qū)域以 CSB-E開(kāi)始，CSB1為中央保守區(qū)域和保守區(qū)域的分界線(xiàn)。

2.3 核苷酸序列比對(duì)分析

使用ClustalW軟件對(duì)玻璃缺鰭鯰、南方鲇、鲇Silurus asotus、黑翅反游貓魚(yú)Synodontis schoutedeni及斑馬魚(yú)Danio rerio的線(xiàn)粒體基因組全序列及13個(gè)編碼蛋白基因的核苷酸序列分別進(jìn)行比對(duì)分析（表3）。序列分析表明，玻璃缺鰭鯰與鲇科其他種屬間具有較高的同源性（序列一致性介于76.23%～86.7%之間），其中與南方鲇最高（86.7%）。5種魚(yú)之間線(xiàn)粒體基因組中COX1基因相對(duì)最保守，相似度為78.98%～92.78%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于12種魚(yú)類(lèi)與人Homo sapiens和小鼠Mus musculus（外群）線(xiàn)粒體基因組D-loop區(qū)核苷酸序列，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。所選擇的12種魚(yú)類(lèi)包括：玻璃缺鰭鯰、南方鲇、鲇、黑翅反游貓魚(yú)、荷馬條鰍Homatula variegatus、虎頭鯊Pangasianodon hypophthalmus、鳙 Hypophthalmichthys nobilis、新疆高原鰍Triplophysa strauchii、蒙古鲌Chanodichthysmongolicus、虹鱒 Oncorhynchusmykiss、斑點(diǎn)叉尾Ictalurus punctatus、大西洋鮭 Salmo salar。從圖1中可以看出，玻璃缺鰭鯰獨(dú)自為一支，但與鲇和南方鲇親緣關(guān)系最近。

圖1 玻璃缺鰭鯰D-loop核酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of catfish Kryptopterus vitreolus based on sequences of D-loop

表3 5種魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組比較Tab.3 Similarity of 13 pairs of homolog gene between 5 fish species

續(xù)表3

3 討論

3.1 線(xiàn)粒體基因組全序列分析

玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體基因組的基因排列順序與已公布的鲇形目魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組完全一致，各基因長(zhǎng)度也基本一致，證明了線(xiàn)粒體基因組在進(jìn)化上的高度保守型。玻璃缺鰭鯰mtDNA的tRNATrp-tRNAAla-tRNAAsn-tRNACys-tRNATyr區(qū)包含一個(gè)典型的“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)[11]，tRNAAsn與tRNACys之間有一段34bp區(qū)域，這段區(qū)域可能是L鏈復(fù)制起點(diǎn)（OL）的“Stemloop”結(jié)構(gòu)[12]。在其他脊椎動(dòng)物中，如兩棲類(lèi)[13]、魚(yú)類(lèi)[14]及哺乳類(lèi)[15]等也有類(lèi)似結(jié)構(gòu)，但在鳥(niǎo)類(lèi)[16]和鱷類(lèi)[17]中尚未發(fā)現(xiàn)。蒲友光等[18]認(rèn)為該結(jié)構(gòu)可能具有種屬特異性，推測(cè)它為脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組的進(jìn)化特征。

在13個(gè)編碼蛋白的基因中有6個(gè)沒(méi)有完整的終止密碼子，包括Cox2、ND3和ND4以T終止，ND2、Cox3和CYTB以TA終止，這種現(xiàn)象普遍存在于線(xiàn)粒體基因組中。雖然沒(méi)有終止密碼子，但其DNA序列表明其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3'末端為T(mén)或TA，加上線(xiàn)粒體mRNA 3'末端含有PloyA尾，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在加工過(guò)程中加接上多腺苷酸后可以形成TAA終止密碼子。

3.2 控制區(qū)（D-loop）結(jié)構(gòu)分析

終止區(qū)域（ETAS）是D-loop區(qū)變異最大的部分，存在不同程度的串聯(lián)重復(fù)序列。一般認(rèn)為，每個(gè)重復(fù)序列中都含有一個(gè)保守的終止相關(guān)序列（termination associated sequences，TAS），由于 TAS 序列均存在著TACATATGTA這一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，它可能是與H鏈復(fù)制終止有關(guān)的信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)參照TAS發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列，在玻璃缺鰭鯰D-loop區(qū)僅識(shí)別到一個(gè)潛在終止序列E-TAS，沙鰍亞科（Botiinae）[19]、鱖屬Siniperca[20]和白魚(yú)Anabarilius grahami[21]也僅含有一個(gè)終止區(qū)域。而朱世華等[22]在大部分鲹科（Carangidae）魚(yú)類(lèi)中識(shí)別到了2個(gè)終止相關(guān)序列。對(duì)于這種多終止相關(guān)序列的現(xiàn)象，劉煥章[23]認(rèn)為只有1個(gè)TAS行使功能，其他的都是復(fù)制的沒(méi)有終止功能。但具體該區(qū)含有幾個(gè)終止相關(guān)序列及其功能問(wèn)題研究的較少，有待進(jìn)一步研究。

中央保守區(qū)CSB是整個(gè)控制區(qū)最為保守的區(qū)域，幾乎在所有的種類(lèi)中都十分保守。曾青蘭等[24]識(shí)別了大口胭脂魚(yú)Ictiobus cyprinellus的CSB-D序列；Lee等[25]對(duì)眾多魚(yú)類(lèi)的序列進(jìn)行比較時(shí)，也僅識(shí)別了CSB-D的存在，而在大部分魚(yú)類(lèi)的研究中都已識(shí)別出CSB-F、CSB-E和CSB-D，并確定了其關(guān)鍵序列。其中CSB-D序列較穩(wěn)定，很容易識(shí)別，CSB-E含有GTGGG-box特殊結(jié)構(gòu)[19-23]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照其他魚(yú)類(lèi)的中央保守區(qū)序列，成功識(shí)別了玻璃缺鰭鯰的CSB-D和CSB-E序列，但未找到CSB-F。

魚(yú)類(lèi)中一般都存在保守序列區(qū)CSB的3個(gè)保守序列區(qū)。有學(xué)者認(rèn)為，CSB1一般與將近完成H鏈替代合成的終止信號(hào)有關(guān)；而CSB2和CSB3可能與H鏈的復(fù)制起始有關(guān)[26]。其中CSB1在魚(yú)類(lèi)中的變異較大，不易識(shí)別。雖然Broughton等[27]和劉煥章[23]認(rèn)為GACATA最為保守，可以幫助識(shí)別CSB1的存在，但在很多魚(yú)類(lèi)卻并非如此。赫崇波等[28]在圓斑星鰈Verasper variegatus識(shí)別出的CSB1并未存在該段保守序列。張燕等[29]在科識(shí)別出的CSB1與之描述也不同，但本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的玻璃缺鰭鯰CSB1序列（TCTATTGACATAACTGGTCC）的特征與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)的CSB1一致。

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

線(xiàn)粒體DNA的D-loop區(qū)長(zhǎng)度和進(jìn)化速率適中,以及富含系統(tǒng)發(fā)育信息等特點(diǎn),被作為DNA通用標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、物種分類(lèi)和系統(tǒng)進(jìn)化研究。彭士明等[30]利用銀鯧Pampus argenteus的線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列比較分析了養(yǎng)殖與野生銀鯧Pampus argenteus群體的遺傳多樣性。董志國(guó)等[31]利用三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列分析了中國(guó)海三疣梭子蟹的遺傳多樣性。姬南京等[32]利用仿刺參Apostichopus japonicas Selenka的線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列分析了大連、朝鮮羅津和俄羅斯海參崴3個(gè)仿刺參群體的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生。本研究應(yīng)用玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體DNA D-loop區(qū)序列與其他鲇形目魚(yú)類(lèi)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析和物種鑒定分析。結(jié)果表明，以D-loop區(qū)序列為標(biāo)記可有效分析鲇形目魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)進(jìn)化與分類(lèi)關(guān)系。目前關(guān)于缺鰭鯰屬的研究有限，線(xiàn)粒體相關(guān)數(shù)據(jù)更是甚微，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)玻璃缺鰭鯰線(xiàn)粒體全基因組序列的測(cè)定，遺傳控制區(qū)的分析，以及系統(tǒng)進(jìn)化的討論，為豐富缺鰭鯰屬基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和促進(jìn)鯰屬系統(tǒng)進(jìn)化研究具有重要意義。

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