乙醇法提取金銀花總黃酮工藝研究

張 君, 朱金艷，祝 軍

(1.沈陽食品檢驗所，遼寧 沈陽 110136；2.莊河市食品檢驗監(jiān)測中心， 遼寧 莊河 116400)

黃酮類化合物是天然產(chǎn)物，主要存在于植物中，許多藥材的有效成分均為黃酮?？傸S酮可以改善人體的血液循環(huán)，降低人體膽固醇含量，降低心腦血管疾病的發(fā)生。它還是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的自由基，可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生，其藥理作用以引起重視。隨著社會進(jìn)步和對健康的追求，研究總黃酮類物質(zhì)取得了一定進(jìn)步，通過進(jìn)一步研究，可以發(fā)揮其更大的作用，創(chuàng)造更多的機(jī)遇，使其在諸多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

本試驗采用乙醇法來提取總黃酮類物質(zhì)，并通過總黃酮類物質(zhì)的定性鑒定(顏色反應(yīng))，確定有機(jī)溶劑提取液含有黃酮類物質(zhì)。再利用單因素通過了不同的提取溫度、乙醇濃度、時間、液固比等條件對金銀花總黃酮提取率的影響，并通過正交試驗設(shè)計，對乙醇法提取金銀花中黃酮類物質(zhì)的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)金銀花總黃酮提供理論依據(jù)，以達(dá)到更加充分、合理的利用金銀花資源提高金銀花附加值的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料 市售金銀花。

1.1.2 試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品；90%乙醇、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鋅粉、硼酸等均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AL204-IC電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酮的提取工藝流程 金銀花→烘干→粉碎篩選→配制溶液→恒溫提取→離心分離→蒸發(fā)濃縮。

1.2.2 金銀花總黃酮含量測定 (1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取11.2毫克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用90%乙醇溶解，定容至50毫升容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4毫升，搖勻；放置60分鐘后加入4%氫氧化鈉溶液4毫升，搖勻；最后用60%的乙醇定容，15分鐘后與420納米處測定吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)制作金銀花總黃酮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10.0毫升蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50毫升比色管中，加入亞硝酸鈉溶液（5%）2毫升，搖勻，并靜置7分鐘，再加入硝酸鋁溶液（5%）2毫升，搖勻，再靜置7分鐘，加入氫氧化鈉溶液（10%）5毫升，以無水乙醇定容至刻度，混勻，靜置20分鐘。以空白試劑為零點(diǎn)，在420nm波長的范圍內(nèi)測定吸光度。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00毫升分別置于25毫升比色管中，按照上述步驟顯色，以空白調(diào)零點(diǎn)，在420納米處測定吸光度。

1.2.3 金銀花總黃酮的定性鑒定 量取金銀花黃酮提取液80毫升于蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至8毫升，備用。(1)鹽酸—鋅粉反應(yīng)。取2毫升樣品置于試管中，加少量鋅粉，搖勻后，滴加數(shù)滴鹽酸，當(dāng)溶液呈粉紅色時證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。(2)硼酸反應(yīng)。取2毫升樣品濃縮液放于試管內(nèi)，加入少許5%硼酸溶液，搖晃，當(dāng)溶液無反應(yīng)時證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。(3)氫氧化鈉反應(yīng)。取2毫升樣品濃縮液放于試管內(nèi)，加入少許氫氧化鈉，搖晃，當(dāng)溶液呈黃色時證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。(4)濃硫酸反應(yīng)。取2毫升樣品濃縮液放于試管內(nèi)，加入少許濃硫酸，搖晃，當(dāng)溶液呈橙紅色時證明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。

1.2.4 單因素試驗 (1)固液比對金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，分別按1∶15、1∶17、1∶19、1∶21、1∶23的固液比加入70%的乙醇中，于65℃回流3小時。相同條件提取兩次，然后將兩次濾液合并，蒸發(fā)濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)三次取平均值。(2)溫度對金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以70%乙醇為提取劑，固液比為1∶19，分別在55、60、65、70、75℃回流3小時。常溫放置冷卻后過濾，濾渣于相同條件下重復(fù)提取1次，然后將兩次濾液合并，蒸發(fā)濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)3次取平均值。(3)時間對金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以70%乙醇為提取劑，固液比為1∶19，在65℃分別回流1、2、3、4、5小時。相同條件提取兩次，然后將兩次濾液合并，蒸發(fā)濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)3次取平均值。(4)乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率的影響。精精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以固液比為1∶19，在65℃分別分別放于乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%回流3小時，放置冷卻后過濾，濾渣在此條件下重復(fù)提取1次，然后將兩次濾液合并，蒸濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 正交試驗提取工藝優(yōu)化 在乙醇法提取金銀花黃酮過程中，對液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度等影響因素進(jìn)行正交試驗。

1.2.6 金銀花總黃酮的測定及含量計算 準(zhǔn)確稱取10毫升的金銀花有機(jī)提取液置于50毫升容量瓶中，按蘆丁顯色標(biāo)準(zhǔn)方法測定金銀花提取液在420納米處測定吸光度，計算金銀花提取物中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（見圖1），得回歸方程：Y=10.88X+0.0073，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。結(jié)果表明，總黃酮含量在該范圍內(nèi)與吸光度線性良好。

圖1 黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程

2.2 金銀花總黃酮的顏色反應(yīng)

依據(jù)總黃酮的定性鑒定方法，含有黃酮類的物質(zhì)在與鹽酸—鋅粉、硼酸溶液、氫氧化鈉溶液、濃硫酸中反應(yīng)，應(yīng)分別顯粉紅色、無反應(yīng)、黃色、橙紅色(表1)。本試驗金銀花提取液的顏色反應(yīng)結(jié)果與定性鑒定的顏色反應(yīng)結(jié)果一致，確認(rèn)金銀花—乙醇的濃縮提取液中含有黃酮類物質(zhì)。

2.3 單因素試驗結(jié)果分析

由單因素試驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)各因素對金銀花總黃酮含量影響程度不同。

2.3.1 固液比對金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析 由表2可知，固液比對金銀花總黃酮提取率的影響，當(dāng)用70%乙醇為有機(jī)溶劑提取金銀花總黃酮時：隨著固液比的增加，金銀花中總黃酮的提取率先增加后下降，當(dāng)固液比在1∶19時，金銀花中總黃酮的提取率最佳，所以在該試驗條件下固液比1∶19最為合適。

2.3.2 溫度對金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析

提取溫度對黃酮得率的影響如表3，在該試驗條件下溫度對金銀花總黃酮的提取率先增加后減少，在65℃時金銀花中總黃酮的提取率最高。

2.3.3 時間對金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析

其他條件不變的情況下，提取時間對金銀花總黃酮提取率的影響結(jié)果見表4，提取時間在0～3小時時提取液中總黃酮類物質(zhì)的濃度隨時間增加而升高，在3小時時達(dá)到最高，即使增加時間濃度也不會提高，所以3小時是最佳的提取時間。

2.3.4 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率結(jié)果分析 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率的結(jié)果如表5，體積分?jǐn)?shù)在70%之內(nèi)隨分?jǐn)?shù)增加而增加，在70%達(dá)到最大濃度3.55%，體積分?jǐn)?shù)超過70%以后即使增加濃度提取率也不會增加，所以在該試驗條件下70%乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳體積分?jǐn)?shù)。

表1 黃酮定性鑒定結(jié)果

表2 固液比對金銀花總黃酮提取率結(jié)果

表3 溫度對金銀花總黃酮提取率的結(jié)果

表4 時間對金銀花總黃酮提取率的結(jié)果

表5 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率的結(jié)果

表6 正交試驗因素水平

表7 金銀花總黃酮提取率正交試驗結(jié)果

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

本試驗對液固比A、乙醇濃度B、時間C、溫度D均不同的正交試驗，見表6和表7。

由表7正交試驗結(jié)果可知，各種因素對金銀花總黃酮含量提取率影響程度依次為A＞B＞C＞D。依實驗結(jié)果可看出，溶劑越多，提取率越高，但由于結(jié)果相近，越多的溶劑會造成資源的大量浪費(fèi)。提取時間對提取率也有一定的影響，時間過短提取不充分，時間過長使得提取周期延長，而且長期處于高溫狀態(tài)可能造成黃酮被高溫破壞，反而降低黃酮的提取率。所以由表分析結(jié)果中數(shù)據(jù)4種因素水平在A2、B2、C3、D1組合時為最佳提取條件，在該條件下提取液中黃酮含量最高，黃酮含量達(dá)到3.55%。

3 結(jié)論與討論

用乙醇提取金銀花總黃酮最佳提取條件為，固液比1∶19，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間為3小時，提取溫度為65℃，在該工藝條件下金銀花黃酮含量為3.55%。在這些條件下，該有機(jī)溶劑提取工藝最優(yōu)化，費(fèi)用最低，提取溶劑使用量最少，提取物易收集，無污染，可實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，是提取金銀花總黃酮的一種非常有效的方法。

目前對黃酮提取的研究基本技術(shù)有3種：水提法；溶劑提取法；超聲波輔助法。如何將幾種簡單的方法配合使用獲得更高的提取率是未來金銀花黃酮類物質(zhì)提取的研究方向。