大型艾美耳球蟲生物學(xué)特性研究

柳南星，方素芳，顧小龍，魏香蒲，梁淑珍，張麗云，李慧峰，崔 平*

(1.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北張家口 075000；2.張家口市經(jīng)開區(qū)農(nóng)委，河北張家口 075000)

兔球蟲病是由一種或數(shù)種艾美耳屬(Eimeria)兔球蟲感染兔后引起的一種寄生蟲病[1]，感染率高，危害大，尤其對斷奶至3月齡仔兔影響嚴(yán)重，主要引起腹瀉、消瘦、生長緩慢[2]，甚至導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)兔業(yè)帶來重大損失[3]。兔球蟲既可單獨致病，也可與大腸埃希菌，沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、輪狀病毒等腸道病原體混合感染，引起較高的發(fā)病率和病死率，是當(dāng)前對我國養(yǎng)兔業(yè)危害較大的病原之一[4]。

大型艾美耳球蟲(E.magna)是引起兔球蟲病的主要球蟲種類之一[5]，會阻礙生長，降低飼料轉(zhuǎn)化率，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對該種球蟲的研究，國內(nèi)外報道甚少，且大多是在混合感染下的研究[6-7]。本研究擬采用不同劑量的純種卵囊感染無球蟲兔，從臨床表現(xiàn)、增重及排卵囊量等方面對大型艾美耳球蟲的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為下一步選用本原始株選育早熟株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 無球蟲兔，用河北北方學(xué)院動物寄生蟲實驗室自行繁育的24日齡斷奶仔兔，提供經(jīng)烤箱高溫烘烤的兔飼料，并在飼料中添加40 mg/kg莫能菌素抗球蟲藥，自由飲水，應(yīng)用飽和鹽水漂浮法對糞便進(jìn)行檢測，檢測不到球蟲卵囊即為合格。試驗前分籠、停藥1周，并單籠飼養(yǎng)。

1.1.2 蟲種 河北北方學(xué)院動物寄生蟲實驗室分離、保存的大型艾美耳球蟲蟲種。

1.1.3 抗球蟲藥物 莫能菌素(monensin)，湖北遠(yuǎn)成原料添加劑有限公司產(chǎn)品；地克珠利(diclazuril)，四川恒通動物制藥有限公司產(chǎn)品；氯苯胍(robenidine)，北京生泰爾生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 潛隱期、最短孢子化時間及卵囊大小的測定 將大型艾美耳球蟲孢子化的卵囊接種給無球蟲兔，接種后清理兔的糞便并糞檢，5 d后每2 h檢查1次糞便中是否有卵囊排出，直至查到有卵囊為止，即為潛隱期；在卵囊孵化時，每隔2 h～3 h吸出少許進(jìn)行鏡檢，觀察發(fā)育過程并確定卵囊的孢子化時間，每次觀察不少于100個卵囊，在400倍顯微鏡下數(shù)碼顯微照相，單位以微米(μm)計。

1.2.2 致病性、免疫原性的試驗分組及感染 將50只無球蟲兔分8組進(jìn)行試驗，1組～7組為感染組(每組6只兔)，各感染組每只兔分別接種孢子化卵囊1×102(第1組)、1×103(第2組)、5×103(第3組)、1×104(第4組)、3×104(第5組)、5×104(第6組)和1×105(第7組)，第8組為不感染對照組(8只兔)，25 d后，除對照組中的4只兔外，其余兔均給予3×104個原始株卵囊的攻蟲量，每只兔每天稱重1次。卵囊排出量分2次測算，第1次為首次接種后6 d～18 d，第2次為攻毒后7 d～15 d，增重量通過方差分析進(jìn)行比較。

根據(jù)臨床癥狀、體重、卵囊排出量的變化、病理剖檢時眼觀變化，從而確定大型艾美耳球蟲的致病性與免疫原性。

臨床：每天觀察和記錄各組兔的糞便情況、精神狀態(tài)、食欲、飲欲等。

體重：每天對各組試驗兔逐一稱重，計算每組兔體重增長情況，并制表記錄。

卵囊計數(shù)：自排卵日起，收集各組兔糞便，用麥克馬斯特法(McMaster’s)計算每天每克糞便卵囊數(shù)(OPG)，直到卵囊全部排完為止，制表記錄。

剖檢：肉眼觀察各組在不同時間內(nèi)腸管的病理變化。

1.2.3 對3種抗球蟲藥的藥敏試驗 將25只無球蟲兔隨機(jī)分為5組，每組5只，并編號，各組兔體重經(jīng)t檢驗，差異不顯著(P>0.05)。1組、2組、3組為人工感染組。4組(為感染不用藥對照組)飼喂常規(guī)飼料，5組為不感染不用藥空白對照組，1組飼喂添加莫能菌素40 mg/kg飼料，2組飼喂添加地克珠利1 mg/kg飼料，3組飼喂添加氯苯胍50 mg/kg飼料。飼喂含藥飼料3 d后，所有試驗兔稱重記錄，感染組兔每只接種1×104個孢子化卵囊。當(dāng)有球蟲卵囊排出時，收集糞便，McMaster’s法計數(shù)每克糞便卵囊數(shù)(OPG)，記錄各組兔耗料量，并計算每只兔平均耗料量和料肉比。

2 結(jié)果

2.1 大型艾美耳球蟲的形態(tài)觀察

大型艾美耳球蟲原始株呈卵圓形，大小為35.7 μm±1.67 μm×24.5 μm±1.47 μm，卵囊形狀指數(shù)為1.46±0.10。卵膜孔十分明顯，呈堤狀突出于卵囊壁之外，卵囊內(nèi)有一個明顯的外殘體，孢子囊有斯氏體，內(nèi)有一個呈顆粒狀的內(nèi)殘體(圖1)。

圖1 分離得到的大型艾美耳球蟲孢子化卵囊 (400×)Fig.1 Sporulated oocyst of Eimeria magna isolated(400×)

2.2 大型艾美耳球蟲的潛隱期和孢子化時間

大型艾美耳球蟲原始株的潛隱期為168 h，27℃下經(jīng)過37 h后30%卵囊孢子化，42 h后85%卵囊孢子化。

2.3 致病性

2.3.1 不同接種劑量的每日排卵囊及總產(chǎn)卵囊量 除對照組外，各試驗組均在接種后的6 d～7 d開始排卵，高劑量感染組卵囊出現(xiàn)的稍晚點，且高峰后排卵囊量突然下降。各組均在排卵后第3～4天卵囊排出達(dá)高峰，持續(xù)11 d～12 d后排卵基本結(jié)束。不同接種劑量試驗兔的卵囊排出總量不同，其中接種5 000個孢子化卵囊排卵囊量最多為4.47×108，其次為100、1 000，接種30 000個卵囊的試驗組兔排卵最少為2.54×108(圖2和圖3)。

圖2 不同接種劑量的每日排卵囊量Fig.2 Daily oocyst outputs after inoculation with different doses

圖3 不同接種劑量的總產(chǎn)卵囊量Fig.3 Total oocyst outputs after inoculation with different doses

2.3.2 臨床癥狀 感染初期，各試驗組兔精神、飲食欲均無明顯的異常。感染后第3天，各組試驗兔均表現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。其中，1、2、3組食欲基本正常，糞便變化不明顯；4、5組感染后第4～5天食欲稍減退，飲欲亦減少，糞便在第5～7天時稍軟，第9天后開始恢復(fù)，第14天時飲食和糞便基本恢復(fù)正常。6、7組在感染后第4～5天，2組兔精神沉郁，被毛蓬亂無光澤，飲欲、食欲減退，甚至廢絕，在第6天接種10萬卵囊的兔有死亡，剖檢出現(xiàn)典型的大型艾美耳球蟲病變。第6～9天時接種兔排軟糞及稀糞，第10天后開始好轉(zhuǎn)，食欲和飲欲都逐漸增加，但仍排稀軟糞便，第12天以后食飲欲、糞便基本恢復(fù)正常。在整個試驗過程中，對照組兔食欲正常，精神狀態(tài)一直良好，糞便球形，顏色正常。大劑量接種組死亡2只兔，死亡率50%。

2.3.3 體重變化 對照組：體重一直呈上升趨勢。

接種100個卵囊組：在感染后第4天和第8天出現(xiàn)2次體重下降，隨后即恢復(fù)正常。

接種1 000個卵囊組：在感染后第7天、第8天出現(xiàn)體重下降，隨后恢復(fù)正常。

接種5 000個卵囊組：在感染后第8～10天連續(xù)3 d體重下降，隨后即恢復(fù)正常。

接種10 000個卵囊組：在感染后第7～8天出現(xiàn)下降，然后逐漸恢復(fù)正常。

接種30 000個卵囊組：感染后第8～9天出現(xiàn)下降，以后逐漸恢復(fù)。

接種50 000個卵囊組：在感染后第7～9天連續(xù)3 d出現(xiàn)體重下降，以后逐漸恢復(fù)正常。

接種10萬個卵囊組：在感染后第5～9天體重出現(xiàn)下降，第10天開始回升，但生長較緩慢。

體重變化情況，詳見圖4。

圖4 不同接種劑量的體重變化Fig.4 Weight gain changes with different inoculation doses

2.3.4 病理剖檢變化 死亡兔剖檢時可見腸壁血管充血，腸黏膜充血并有點狀出血(圖5)。有大量黏液和氣體于腸道中(圖6)?？漳c、回腸黏膜抹片可見不成熟的卵囊，內(nèi)容物抹片可見腸道中脫落的成熟卵囊(圖7)。

綜上所述，大型艾美耳球蟲原始株的致病性較強(qiáng)，能夠產(chǎn)生明顯臨床癥狀，嚴(yán)重影響家兔正常發(fā)育。

圖5 腸壁血管充血,腸黏膜充血并有點狀出血Fig.5 Congestion of intestine wall,intestine mucosa congestion and petechial hemorrhage

圖6 腸道內(nèi)充滿氣體和大量黏液Fig.6 Intestine lumen filled with gas and plenty of mucous

圖7 腸道內(nèi)容物抹片可見的成熟卵囊(400×)Fig.7 Mature oocysts on intestinal content smear (400×)

2.4 免疫原性

2.4.1 臨床癥狀及體重變化 低劑量免疫(100個卵囊)可以對30 000個卵囊的攻毒產(chǎn)生完全的保護(hù)力。免疫組的兔糞便正常，精神狀態(tài)，飲欲食欲良好，不免疫攻毒組的兔出現(xiàn)拉稀，精神委頓，食欲不振，平均增重出現(xiàn)負(fù)值，與不免疫不攻毒組差異極顯著(P<0.01)，死亡率為11%。100個/只免疫組增重與不免疫不攻毒組差異不顯著(P>0.05)。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，免疫組在攻蟲4 d～10 d后，增重量顯著降低(P<0.01)，但未出現(xiàn)腹瀉癥狀，這證明了先前接種的效果。第17天出現(xiàn)增重補(bǔ)償效應(yīng)。陽性對照組與先前至少接種1 000個原始株組的卵囊在增重上無顯著差異(P>0.05)。觀察到先前接種30 000、50 000、100 000個卵囊的兔組，攻蟲后增重不顯著(圖8)。

圖8 攻毒后不同接種劑量的增重Fig.8 Weight gain after challeng with different inoculation doses

2.4.2 卵囊排出量 不同蟲量免疫攻蟲組的OPG均很低，明顯低于不免疫攻蟲組，甚至不排卵，呈完全保護(hù)，免疫原性良好。

2.5 對3種抗球蟲藥的藥敏特性

莫能菌素組、地克珠利組和不感染不用藥對照組兔在整個試驗期間采食、糞便、精神狀態(tài)未見異常，生長較快，未出現(xiàn)死亡。氯苯胍組和感染不用藥對照組兔在試驗中陸續(xù)出現(xiàn)食欲下降，采食量減少，精神沉郁，繼而出現(xiàn)腹瀉，特別是感染不用藥對照組最后腹瀉加重(個別伴有腹脹)，食欲更差以至廢絕，糞少，兔體消瘦。第10天起兔拉稀逐漸減輕，精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，采食量也開始增加，未出現(xiàn)死亡，但至試驗結(jié)束時，感染不用藥對照組比用藥的各個試驗組的兔被毛蓬亂，體質(zhì)消瘦。

在試驗期間除空白對照組，各試驗組在感染第7天均有卵囊排出，第10天達(dá)到高峰。結(jié)果表明，所選藥物對大型艾美耳球蟲原始株均不是高度敏感，相比之下莫能菌素抑制卵囊排出效果較好，地克珠利次之，氯苯胍最差。

在試驗期間各組兔相對增重率由大到小依次是莫能菌素組99.1%，地克珠利組68.3%，氯苯胍組61.3%，感染不用藥組59.8%；莫能菌素組兔的平均增重與不感染不用藥對照組比較差異不顯著(P>0.05),地克珠利組和氯苯胍組與不感染不用藥組比較差異極顯著(P<0.01)。說明莫能菌素能夠較好地抑制大型艾美耳球蟲對家兔生長發(fā)育的影響。

平均飼料轉(zhuǎn)化率，即所消耗飼料量與增重量的比，由低到高分別為莫能菌素組1.50%、地克珠利組1.92%、氯苯胍組2.16%，均高于感染不用藥組2.39%。說明莫能菌素對大型艾美耳球蟲的治療效果最好，家兔的生長發(fā)育最佳。詳細(xì)結(jié)果見表1。

綜上所述，大型艾美耳球蟲原始株對莫能菌素最為敏感，地克珠利次之，氯苯胍最差。

表1 大型艾美耳球蟲原始株對3種抗球蟲藥的敏感性

3 討論

3.1 形態(tài)、潛隱期、孢子化時間

本研究中的大型艾美耳球蟲原始株形態(tài)大小與文獻(xiàn)中報道的基本一致，最小潛隱期可以作為鑒別在同一宿主體內(nèi)不同蟲種的依據(jù)[8]。同樣，在相同條件下，最短孢子化時間也可作為種的特征。本試驗測得大型艾美耳球蟲最小潛隱期168 h；在25 g/L重鉻酸鉀液、27℃恒溫條件下，最短孢子化時間為37 h。不同研究者對大型艾美耳球蟲潛隱期測定值不盡相同，說明不同地理株可能存在一定差別，也可能和試驗條件有關(guān)。

3.2 致病性

不同種的兔球蟲具有不同的致病力，如穿孔艾美耳球蟲(E.perforans)只有2代裂殖生殖，致病力較弱[9]，而大型艾美耳球蟲具有4 代裂殖生殖，致病力較強(qiáng)。感染大型艾美耳球蟲卵囊引起的部分臨床癥狀與Ryley報道的基本相同。試驗組的體重均下降，推測是由于孢子化卵囊進(jìn)入機(jī)體發(fā)生裂殖生殖破壞上皮細(xì)胞所致，球蟲感染時的體重下降，在很多研究中都有報道[10-12]。

3.3 免疫原性

目前，對于兔球蟲免疫原性的鑒定，主要是以免疫兔攻蟲后的臨床癥狀、增重水平及卵囊排出量3個方面的指標(biāo)來衡量。Pakandl M[13]將11個種的兔球蟲免疫原性進(jìn)行劃分，其中腸艾美耳球蟲具有強(qiáng)免疫原性，中型艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲及無殘艾美耳球蟲具有中等免疫原性，而黃艾美耳球蟲和梨形艾美耳球蟲則被認(rèn)為免疫原性較差[14]。本試驗的結(jié)果與Pakandl M的劃分相一致，大型艾美耳球蟲原始株具有良好的免疫原性。

3.4 藥敏特性

根據(jù)臨床表現(xiàn)、排卵量、飼料轉(zhuǎn)化率，試驗用的3種抗球蟲化學(xué)藥物中，莫能菌素對大型艾美耳球蟲原始株有良好效果，可作為防治家兔感染大型艾美耳球蟲的首選藥之一，但不屬于高效抗球蟲藥[15]，這與周文江等[16]等報道莫能菌素為高效抗球蟲藥在效果上有差別，可能與接種的蟲種有關(guān)。地克珠利、氯苯胍無論是抑制卵囊排出、飼料轉(zhuǎn)化率都較差，這與殷佩云[17]的結(jié)論相一致。

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