牡丹花瓣高效液相色譜指紋圖譜研究*

華梅,原曉龍,王毅,楊衛(wèi),陳劍,馬惠芬,呼延麗,楊宇明,王娟

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明650201;2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650201)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為毛茛科(Ranunculaceae)芍藥屬(Paeonia)多年生落葉小灌木?；ㄉ珴善G麗,素有“花中之王”的美譽(yù)。牡丹品種繁多，色澤亦多，以黃、綠、肉紅、深紅、銀紅為上品，尤其黃、綠為貴。牡丹花大而香，故又有“國色天香”之稱[1-2]。牡丹不僅有觀賞價(jià)值，而且還具有很高的藥用價(jià)值[3-4]。將牡丹的根莖加工制成“丹皮”，是名貴的中草藥。

牡丹除了觀賞、藥用外，其種子可榨油。油用牡丹是一種新興的木本油料作物，具備高產(chǎn)出、高含油率(籽含油率22%)、高品質(zhì)(不飽和脂肪酸含量92%)和低成本(油用牡丹耐旱耐貧瘠，適合荒山綠化造林、林下種植；一年種百年收，成本低)的特點(diǎn)[5-6]。經(jīng)國際權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)PONY檢測和國家糧油中心檢測分析：牡丹籽油不飽和脂肪酸含量92%，其中α-亞麻酸的含量超過40%。因含有較高比例的亞麻酸，牡丹油一度被稱為“液體黃金”[7-8]。從2011年3月始，牡丹籽油已被國家衛(wèi)生部監(jiān)督局列為新資源食品，牡丹籽正式成為我國木本油料研究中的新型油料[9]。目前用于商業(yè)生產(chǎn)中的油用牡丹僅有鳳丹(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang)和紫斑(Paeoniarockii)2個(gè)品種。因此在各地大力推廣油用牡丹的同時(shí)，具有觀賞、藥用和油用價(jià)值的牡丹也在各地大規(guī)模的引種種植。在引種種植牡丹獲得觀賞、藥用和油用價(jià)值的同時(shí)，也獲得大量的附加產(chǎn)品，如牡丹花瓣產(chǎn)品及從牡丹花瓣中提取類黃酮及花青素。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，牡丹花瓣中主要的類黃酮有異杞柳苷、山奈酚、槲皮素和異鼠李素等[10]，主要的花青素為矢車菊素、芍藥素和天竺葵素[11]。類黃酮和花青素都具有非常高的藥用價(jià)值[12-13]，常用的檢測方法有紫外可見分光光度法(UV-VIS)和高效液相色譜法(HPLC)[14]，HPLC法在定性分析及含量測定方面具有廣泛的應(yīng)用[15-16]。采用現(xiàn)代光譜(中紅外光譜MIR[17]、紫外光譜UV[18])、色譜技術(shù)〔高效液相色譜(HPLC[19])、氣相色譜(GC[20])、高效薄層色譜(HPTLC[21])〕構(gòu)建特征圖譜的指紋圖譜技術(shù)，為質(zhì)量評價(jià)提供了技術(shù)支撐[22]。郭鑫等采用指紋圖譜技術(shù)對8個(gè)不同產(chǎn)地秦艽(Gentianamacrophylla)主要藥性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明8個(gè)不同產(chǎn)地秦艽指紋圖譜共有6個(gè)主要共有峰，可作為鑒別和控制秦艽藥材質(zhì)量的主要依據(jù)[23]。朱玲英等研究建立鳳仙透骨草(Impatiensbalsamina)HPLC指紋圖譜分析方法,為其質(zhì)量控制和藥材鑒別提供依據(jù)，該方法準(zhǔn)確、簡單、穩(wěn)定,可用于鳳仙透骨草的鑒別和質(zhì)量控制[24]。

為了解在引種種植過程中牡丹花瓣活性成分的變化，達(dá)到控制牡丹花瓣樣品質(zhì)量的要求，本研究首次采用高效液相(HPLC)指紋圖譜法，對不同引種種植地不同品種牡丹花瓣樣品中化學(xué)成分進(jìn)行分析，以期建立不同引種地不同品種牡丹花瓣樣品指紋圖譜的分析方法，并評價(jià)各引種牡丹花瓣樣品的相似度，最終達(dá)到控制其質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料 9批牡丹花瓣樣品均為引種，分別采自曲靖馬龍牡丹種植基地和云南省林業(yè)科學(xué)院樹木園牡丹種植基地，品種有魯粉、白雪塔、雪里紫玉、趙粉、芳紀(jì)、鳳丹(白色花和粉色花)，詳細(xì)見表1。

表1 不同批次牡丹花瓣樣品

注：云南省林業(yè)科學(xué)院樹木園牡丹種植基地的牡丹采集時(shí)間為2016年3月28日；曲靖馬龍牡丹種植基地采集時(shí)間為2016年3月30日。

試劑 乙腈、甲醇為色譜純；水為蒸餾水。槲皮素、異鼠李素、山奈酚對照品購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),Agilent Eclipse plus C18色譜柱(4.6×150mm,5μm)，ChemStation色譜工作站，具塞試管(20mL)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 對照品溶液的配制 精密稱取對照品槲皮素、異鼠李素、山奈酚各23.6mg,用10mL甲醇分別配制成2.36mg/mL的對照品溶液。

(2)供試品溶液的配制 精密稱取牡丹花瓣鮮花(實(shí)際稱量重量如表1所示),于液氮中研碎后放入具塞試管中，分別加入10mL 70%甲醇溶液(白色花)或1%濃鹽酸的甲醇(粉色花)，置于冰箱中4℃過夜提取。提取液用0.45μm 針頭過濾器過濾后于4℃冰箱保存，用于HPLC分析。

(3) HPLC色譜條件 采用Eclipse plus C18色譜柱(4.6×150mm,5μm)，以1%乙酸(A)-乙腈(B)作為流動(dòng)相梯度進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)間為0-10min，0%-20%B；10-40min，20%-60%B；40-50min，60%-20%B；50-60min，20%-60%B，流速0.8mL/min，檢測波長360nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL。

(4) 指紋圖譜評價(jià)方法 采用國家藥典委員會(huì)開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2004A)生成對照指紋圖譜，作為指紋圖譜相似度評價(jià)的基礎(chǔ)圖譜。

(5) 聚類分析方法 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件，以6個(gè)共有峰的峰面積為變量對結(jié)果進(jìn)行聚類分析(Euclidean 和ward法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立與分析

2.1.1 共有峰的色譜圖及樣品特征圖譜

圖1為S1樣品的HPLC圖，圖中標(biāo)示出1-6號峰，各峰都實(shí)現(xiàn)了基線分離。將9個(gè)不同引種地不同品種牡丹花瓣樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行指紋圖譜分析。經(jīng)分析，9個(gè)樣品共標(biāo)定了6個(gè)共有峰，結(jié)果如圖2所示。從下往上色譜峰圖相對應(yīng)的樣品為S1-S9，最上邊的R為中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)生成的對照光譜圖。每個(gè)樣品共有峰總面積比例均>95%，符合指紋圖譜研究的要求。6個(gè)共有峰中，第5號峰分離度好，峰面積最大，以每個(gè)樣品的第5號峰為參照峰(S)，分別計(jì)算各共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間，結(jié)果見表2。

圖1 S1樣品HPLC色譜圖

圖2 9個(gè)牡丹花瓣樣品HPLC特征圖譜重疊圖

編號12345(S)6S1069107080916097710001029S2069107110916097710001030S3069107090916097710001029S4069207090916097710001029S5069107090916097710001029S6069207090917097710001029S7069207130917097710001029S8069207130916097710001029S9069207120917097810001029平均值069207100916097710001029RSD/%009602660073003410000047

表3 9個(gè)牡丹花瓣樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積

從樣品共有峰的相對保留時(shí)間(表2)可以看出，各樣品共有峰的相對保留時(shí)間非常接近，RSD在0.034 1%-0.265 6%，表明共有峰選擇的準(zhǔn)確性。從表3樣品共有峰的相對峰面積結(jié)果可以看出，不同樣品各共有峰的峰面積相差比較大，表明不同引種地不同品種間相同的成分含量差異顯著。

2.1.2 樣品相似度結(jié)果

在中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)中采用夾角余弦法，以S1號樣品的譜圖峰為對照峰，對各樣品進(jìn)行整體相似度評價(jià)。將9個(gè)樣品譜圖導(dǎo)入相似度系統(tǒng)，軟件自動(dòng)生成各樣品的相似度結(jié)果，結(jié)果見表4。

表4 9種不同引種牡丹花瓣樣品相似度

從表4可以看出，9個(gè)樣品相似度最高為0.999,最小為0.862，平均相似度為0.984，表明9個(gè)樣品整體差異不大。

2.2 含量差異分析

通過對槲皮素、異鼠李素、山奈酚對照品的比較，確定了2號峰、4號峰及6號峰分別為槲皮素、山奈酚和異鼠李素。根據(jù)不同樣品中槲皮素、異鼠李素、山奈酚的峰面積結(jié)果可以看出，牡丹花瓣樣品相同成分的含量差異性很大,異鼠李素含量最高的樣品為S9，山奈酚含量最高的樣品為S9，槲皮素含量最高的樣品為S6(表5)。

2.3 不同產(chǎn)地牡丹花瓣樣品聚類分析

以不同引種地牡丹花瓣共有峰面積為變量,對9個(gè)不同引種地的牡丹花瓣樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果(圖3)可知,S4、S7與S3樣品最先聚為一類,S2、S5樣品和S8樣品聚為一類，S1樣品和S6樣品聚為一類，說明各引種地及不同品種間相同成分的含量差異較大。

2.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)取S1號樣品，連續(xù)進(jìn)樣 5 次，記錄圖譜，考察各共有峰的相對保留時(shí)間及峰面積的RSD。結(jié)果(表6)表明，各色譜峰的相對保留時(shí)間基本一致，共有峰1峰面積的RSD為1.8%( RSD值<5%)。

圖3 9個(gè)牡丹花瓣樣品的聚類分析樹狀圖

S1共有峰1峰面積/mAU峰面積平均值/mAURSD/%12423922391232476624538218424931524843

表7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

重現(xiàn)性試驗(yàn)取S4號樣品5份，按供試品溶液制備方法操作，記錄圖譜，考察各共有峰的相對保留時(shí)間及峰面積的RSD。結(jié)果(表7)表明，各色譜峰的相對保留時(shí)間基本一致，共有峰1峰面積的RSD為2.1%(RSD值<5%)。

表8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)取S6號樣品，分別在0、5h、9h、12h、15h、18h測定,記錄圖譜，考察各共有峰的相對保留時(shí)間及峰面積的RSD。結(jié)果(表8)表明，各色譜峰的相對保留時(shí)間基本一致，共有峰1峰面積的RSD為3.6%(RSD值<5%)。

通過方法學(xué)考察，以樣品的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)的儀器的精密度，樣品的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性均符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

3 結(jié)論與討論

指紋圖采用一定的分析手段(MIR、UV、HPLC、GC、HPTLC)[17-21]，得到能夠標(biāo)示其特征性共有峰的圖譜，強(qiáng)調(diào)了同一藥材群體的相似性，即物種群體內(nèi)的唯一性。通過指紋圖譜的特征性可以有效鑒別樣品真?zhèn)闻c產(chǎn)地，通過對其主要特征峰面積或比例的限定，可有效控制樣品的質(zhì)量[22]。牡丹花瓣，作為牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的副產(chǎn)品之一，對其中化學(xué)成分的分析極為重要。尤其是不同產(chǎn)地不同品種牡丹花瓣主要成分的分析及組成差異分析，對牡丹花瓣產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。指紋圖譜能實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地不同品種牡丹花瓣間化學(xué)成分差異的分析，高效液相色譜能對牡丹花瓣樣品的成分進(jìn)行快速、高效的分析。高效液相色譜與指紋技術(shù)的聯(lián)合，能為牡丹花瓣的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

本研究采用高效液相色譜進(jìn)行分析,比較研究了不同引種地不同品種牡丹花瓣主要成分差異，采用指紋圖譜相似度評價(jià)軟件首次建立了引種牡丹花瓣HPLC指紋圖譜。圖譜顯示了不同引種地不同品種牡丹花瓣有效成分差異以及主要成分分布情況，分離標(biāo)定出6個(gè)共有峰。共有峰峰形良好，分離度高，可作為牡丹花瓣的特征指紋。以峰面積的變化情況考察了儀器的精密度，同時(shí)考察了樣品在制備及放置過程中的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性，結(jié)果均符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

通過對槲皮素、異鼠李素、山奈酚對照品色譜圖的比較，確定了2號峰、4號峰及6號峰分別為槲皮素、山奈酚和異鼠李素。分析不同樣品槲皮素、異鼠李素、山奈酚的峰面積結(jié)果，表明不同引種地不同品種牡丹花瓣樣品相同成分的含量差異性很大。在相似度評價(jià)系統(tǒng)中以S1號樣品的譜圖峰為對照峰，對各樣品進(jìn)行整體相似度評價(jià)，結(jié)果表明9個(gè)樣品整體差異不大。以不同引種地牡丹花瓣共有峰面積為變量，對9個(gè)不同引種地的牡丹花瓣樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果可知，各引種地不同品種間相同成分的含量差異較大。本研究建立的牡丹花瓣指紋圖譜技術(shù)，可為評價(jià)各引種地牡丹花瓣樣品的相似度和最終控制其產(chǎn)品質(zhì)量提供方法支撐。

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