富鉀烤煙品種成熟期鉀素代謝特征研究

張小全，張鋆鋆，劉冰洋，闞洪贏(yíng)，郭傳濱，楊立均，夏宗良

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002；2 河南省煙草公司駐馬店市公司，駐馬店 463000；3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002）

鉀是煙草生長(zhǎng)必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，有重要的營(yíng)養(yǎng)和生理作用，與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)[1]。煙葉鉀含量偏低是我國(guó)煙葉與國(guó)際優(yōu)質(zhì)煙葉品質(zhì)差異的重要原因之一[2]。研究煙草高效吸收鉀的機(jī)理，選育含鉀量高的煙草新品種，提高煙株鉀素營(yíng)養(yǎng)效率，對(duì)促進(jìn)我國(guó)優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)具有重要的意義。

不同煙草品種的吸鉀能力、葉片含鉀量及鉀的營(yíng)養(yǎng)效率存在顯著的差異。楊鐵釗等對(duì)鉀含量不同的基因型的鉀積累特性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，富鉀煙草基因型ND202具有鉀積累速率高和高積累速率持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)兩個(gè)重要特征[3]。采用盆栽和水培的方法對(duì)旺長(zhǎng)期富鉀煙草基因型ND202鉀高效積累的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，富鉀基因型烤煙根系發(fā)達(dá)，根系活力強(qiáng)，根系分泌物活化能力強(qiáng)，根系具有較高的鉀吸收速率等特點(diǎn)[3–9]。鉀在植物體內(nèi)流動(dòng)性很強(qiáng)，根吸收的鉀離子其中一部分通過(guò)韌皮部運(yùn)回到根中，再轉(zhuǎn)入木質(zhì)部繼續(xù)向上運(yùn)輸，從而形成鉀在植株根與地上部之間的循環(huán)流動(dòng)，旺長(zhǎng)期煙株運(yùn)往地上部的鉀大約有20%～40%可回流到根中，而打頂后煙株運(yùn)往地上部的鉀大約有50%～70%可回流到根中[10]。煙草成熟期是決定煙葉鉀含量的關(guān)鍵時(shí)期，打頂可導(dǎo)致由根系向地上部運(yùn)輸?shù)拟涬x子減少，根系鉀離子外溢量會(huì)顯著增加，從而使煙葉中鉀累積量降低[11]，同時(shí)烤煙葉片同樣可以存在鉀素的外流[12]。而成熟期富鉀煙草基因型高效吸收鉀的機(jī)理卻鮮有報(bào)道。本研究選用富鉀烤煙品種ND202和常規(guī)品種K326、NC89進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，分析了不同烤煙品種生長(zhǎng)過(guò)程中非根際和根際土壤速效鉀含量的變化，成熟期根系生理特性差異，成熟期不同部位鉀積累量、鉀通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)差異，旨在探明煙草富鉀基因型成熟期鉀素代謝特征，探究煙草高效吸收鉀的機(jī)理，為富鉀烤煙基因型的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為富鉀烤煙品種ND202，對(duì)照品種為K326、NC89。種子由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2016年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭州科教園區(qū)進(jìn)行。將種子消毒、浸種、催芽后播于裝有蛭石、珍珠巖、草木灰和適量化肥的塑料格盤(pán)內(nèi)育苗，至5葉1心時(shí)挑選生長(zhǎng)健壯、整齊的煙苗進(jìn)行移栽。

試驗(yàn)采用盆栽種植 (每盆裝25 kg土)，供試土壤為肥力一致的壤質(zhì)潮土，基本理化性狀為有機(jī)質(zhì)11.50 g/kg、全氮0.85 g/kg、全磷0.11 g/kg、速效鉀120 mg/kg、緩效鉀675 mg/kg、pH 7.67。煙苗5月3日移栽，每個(gè)材料種植180株。施用肥料為NH4NO3、NaH2PO4和K2SO4，分別在移栽時(shí)、移栽后第1周、移栽后第2周分3次施入，3次施肥量比例為2∶1∶1。移栽后，使用田間滴灌系統(tǒng)進(jìn)行水分管理，保持土壤田間持水量在80%左右。煙株第一朵中心花開(kāi)放50%時(shí)，進(jìn)行打頂，每株留葉數(shù)為22片，按優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行田間管理。

在移栽后 35 d (團(tuán)棵期)、65 d (旺長(zhǎng)期)、85 d (成熟期) 各處理中分別隨機(jī)選取6株生長(zhǎng)整齊的健壯煙株，小心將煙株從盆中取出，防止傷及煙株根系，去掉2 cm的表層土壤，輕輕抖動(dòng)煙株根系外圍土壤，即為非根際土；然后慢慢去除根系周?chē)^大土塊，用毛刷輕輕從煙株根系表面刷下土壤，即為根際土。不同處理的根際土和非根際土分別充分混合均勻，各分為三份，用作土壤速效鉀含量檢測(cè)。

在成熟期 (移栽后85 d)，各處理選取生長(zhǎng)整齊一致的健壯煙株18株，其中6株用于根系體積、根重、根系活力測(cè)定。6株用于鉀含量測(cè)定，根、莖、葉分開(kāi)，煙株葉片從下往上第1～6片葉為下部葉，第7～16片葉為中部葉，第17～22片葉為上部葉，于烘箱中105℃殺青30 min，70℃烘干用于鉀含量測(cè)定。6株用于鉀相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定，取煙株葉片從下往上第3葉位 (下部葉)、第10葉位 (中部葉)、第20葉位 (上部葉) 等各部位取10 g左右的煙葉，并取10 g左右的須根 (用去離子水清洗干凈)，每?jī)芍陮?duì)應(yīng)樣品混合，每個(gè)部位均含3個(gè)重復(fù)樣品，分開(kāi)存放，–80℃保存，用于鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

根際土和非根際土速效鉀含量的測(cè)定采用乙酸銨浸提—火焰光度法[13]。

植株鉀含量采用鹽酸溶液浸提—火焰光度法，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定[14]。

根系鮮重、根系干重的測(cè)定采用稱(chēng)重法，根系體積的測(cè)定采用排水法，根系活力的測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑 (TTC) 法[8]。

鉀相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定：采用trizol法提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì) (Thermo Scientific，USA)測(cè)定濃度及OD260/OD280，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme，R223-01) 將待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物采用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。內(nèi)參基因?yàn)闊煵軦CTIN基因。利用QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit試劑盒(Qiagen，Germany) 在 LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀 (Roche，Swiss) 上進(jìn)行反應(yīng)。體系：2 ×QuantiFast? SYBR? Green PCR Master Mix，5 μL；10 μM Forward primer，0.2 μL；10 μM Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR 程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化。所有的樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，基因相對(duì)表達(dá)水平用 2–△△CT方法進(jìn)行計(jì)算[15]。

表 1 目的基因引物序列Table 1 Primer of target genes

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS21 軟件進(jìn)行One-way ANOVA方差分析和多重比較，文中的數(shù)據(jù)表示為平均值 ± SD。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烤煙品種成熟期鉀積累特性差異

成熟期不同部位樣品的鉀含量見(jiàn)表2，烤煙成熟期不同器官的鉀含量變化呈現(xiàn)出“葉 ＞ 莖 ＞ 根”的規(guī)律；NC89煙葉中的鉀含量隨著部位的降低而增大，而ND202與K326卻恰好相反；就烤煙煙葉的不同部位而言，無(wú)論是哪個(gè)部位，ND202煙葉中的鉀含量均是最大，且與其他品種存在顯著性差異。

鉀積累量是研究植物鉀吸收特性的重要指標(biāo)，在一定程度上，能夠反映植物的鉀吸收效率。而干物質(zhì)重與鉀積累量關(guān)系密切。由表3可知，烤煙中部葉和莖的干物質(zhì)量最大；不同品種上部葉、莖、根的干物質(zhì)重差異不顯著；ND202中部葉的干物質(zhì)重最大，比NC89高83.06%，與其他兩個(gè)品種存在顯著性差異；下部葉的干物質(zhì)重品種間存在極顯著差異；ND202植株的干物質(zhì)總重達(dá)到497.75 g/株，與其他兩個(gè)品種存在顯著差異。

由表4可知，整體上來(lái)說(shuō)，烤煙植株在葉片中鉀素的積累量最高，遠(yuǎn)高于莖中的積累量，根中鉀的積累量最低。就葉片來(lái)說(shuō)，烤煙在中部葉中的鉀積累量最大。ND202葉片中的鉀積累量極顯著地高于其他品種，莖和根中的鉀積累量品種間差異不顯著。全株鉀積累量以ND202最高，達(dá)到10.18 g/株，分別比NC89和K326高109.9%和90.3%，差異達(dá)極顯著水平。說(shuō)明ND202具有較強(qiáng)的鉀積累能力。

2.2 不同烤煙品種成熟期根系生理特性比較

由不同烤煙品種成熟期根系生理特性(表5)可知，成熟期富鉀品種ND202的平均根鮮重、根干重、根體積、根系活力均較K326和NC89高，其中根鮮重和根體積顯著地高于K326，根系活力顯著地高于NC89。說(shuō)明成熟期ND202根系較發(fā)達(dá)，根系吸收能力較強(qiáng)。

2.3 不同烤煙品種根際土壤速效鉀含量比較

隨著生長(zhǎng)時(shí)期的推移，烤煙植株根際土壤速效鉀含量呈現(xiàn)出逐步增加的趨勢(shì)(表6)。富鉀品種ND202根際土壤速效鉀含量分別在團(tuán)棵期極顯著地低于NC89，在旺長(zhǎng)期極顯著地低于K326，在成熟期更是極顯著地低于其他2個(gè)品種，說(shuō)明ND202與其他2個(gè)品種相比在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有較強(qiáng)的鉀素吸收能力。非根際土壤速效鉀含量NC89和K326均是在旺長(zhǎng)期最高，ND202則是隨著生長(zhǎng)時(shí)期的推進(jìn)，含量逐步升高，并在成熟期極顯著地高于NC89和K326，說(shuō)明ND202根系活化土壤礦物鉀的能力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，活化能力較強(qiáng)。

表 2 不同烤煙品種成熟期不同部位鉀含量 (%)Table 2 Potassium contents in different parts of different flue-cured tobacco cultivars at the mature stage

表 3 不同烤煙品種成熟期不同部位干物質(zhì)的積累量 (g/plant)Table 3 Accumulation of dry matter in different parts of different flue-cured tobacco cultivars at the mature stage

表 4 不同烤煙品種成熟期不同部位鉀積累量 (g/plant)Table 4 Potassium accumulation in different parts of different flue-cured tobacco cultivars at the mature stage

表 5 不同烤煙品種成熟期根系生理特性Table 5 Root physiological characteristics of different flue-cured tobacco cultivars at the mature stage

表 6 不同烤煙品種不同生長(zhǎng)時(shí)期根際土壤速效鉀含量 (mg/kg)Table 6 Readily available potassium contents in rhizosphere soil of different cultivars during different growth periods

2.4 不同烤煙品種成熟期鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)差異

目前，關(guān)于烤煙鉀離子通道基因方面的報(bào)道很多[16]。試驗(yàn)選定了與烤煙根系吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鉀素過(guò)程關(guān)系最為密切的NKT1、NTORK1、NtTPK1、NtKC1等4個(gè)通道基因和NtHAK1、NtKT12等2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因進(jìn)行研究。

2.4.1 鉀離子通道基因NKT1和NtKC1基因?qū)儆趦?nèi)流型鉀離子通道基因。NKT1主要在根細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)，可促進(jìn)植物根細(xì)胞對(duì)土壤中鉀的吸收[11,17–20]，因此NKT1表達(dá)量增加對(duì)提高烤煙鉀素累積是有利的。由圖1可知，成熟期NKT1在根中的表達(dá)量相對(duì)較高，但品種間差異不顯著，在上部葉中ND202的NKT1表達(dá)量顯著高于K326和NC89，中部葉中3個(gè)品種間差異不明顯，下部葉中NC89的NKT1表達(dá)量顯著高于其他品種。NtKC1基因在烤煙的葉片和根系中均有表達(dá)，但在根系中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在葉片中的表達(dá)量，這與郭兆奎等人的研究結(jié)果一致[21]。成熟期ND202在根、上部煙和中部葉中NtKC1的相對(duì)表達(dá)量極顯著地高于NC89和K326。說(shuō)明成熟期ND202具有相對(duì)較高的鉀素吸收能力。

圖 1 不同品種成熟期不同部位鉀離子通道基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 1 Relative expression of potassium channel gene in different parts of different cultivars at the mature stage

NTORK1屬于外流型鉀離子通道基因[22–24]。由圖1可知，該基因在根、上部葉和中部葉中的相對(duì)表達(dá)量品種間差異極顯著，均以ND202最高，說(shuō)明富鉀品種ND202的鉀代謝運(yùn)輸旺盛，外排較多。而在成熟期葉齡較大的下部葉中，ND202的相對(duì)表達(dá)量則極顯著地低于NC89和K326，鉀素外排較少有利于鉀含量的提高。

NtTPK1基因包含典型的鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能保守域,具有KCO家族的鉀吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的生物學(xué)功能[25]。成熟期富鉀品種ND202 該基因的相對(duì)表達(dá)量在下部葉中極顯著地低于其他品種，在根、中部葉中極顯著地高于NC89和K326，在上部葉中極顯著地高于K326，說(shuō)明ND202在成熟期對(duì)鉀具有較強(qiáng)的吸收能力。

2.4.2 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NtHAK1和NtKT12基因是煙草中重要的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，其表達(dá)量的高低與烤煙品種的富鉀能力密切相關(guān)[16,26]。由圖2可知，3個(gè)品種不同部位NtHAK1基因的表達(dá)量存在極顯著的差異，且各部位表達(dá)量相當(dāng)。成熟期ND202在根、上部葉和中部葉中NtHAK1的相對(duì)表達(dá)量均呈極顯著地高于K326和NC89。成熟期3個(gè)品種根、上部葉和中部葉NtKT12基因的表達(dá)量存在極顯著的差異，且葉片的表達(dá)量高于根。ND202在根和上部葉中NtKT12的相對(duì)表達(dá)量均呈極顯著地高于K326和NC89。說(shuō)明富鉀品種ND202在成熟期具有較強(qiáng)的鉀素運(yùn)轉(zhuǎn)和積累能力。

3 討論

圖 2 不同品種成熟期不同部位鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative expression of potassium transporter gene in different parts of different cultivars at the mature stage

植物生長(zhǎng)所需的鉀素絕大部分來(lái)自土壤, 而根系是植物從土壤中獲取鉀的主要器官, 因此, 根系吸鉀功能的發(fā)揮與根系生理特性密切相關(guān)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，富鉀品種ND202在成熟期仍然具有根系發(fā)達(dá)、根系吸收能力較強(qiáng)、根系活化土壤礦化鉀的能力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、活化能力較強(qiáng)的特點(diǎn)。Batten等總結(jié)了鉀高效吸收基因型根系所具有的特征：根冠比高，根系縱向、側(cè)向分布廣，根多且細(xì)，根毛多且長(zhǎng)，根系吸收面積和活躍面積大，理想的根系吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)[28]。前期研究也發(fā)現(xiàn)富鉀品種ND202旺長(zhǎng)期根系活力、H+分泌量、陽(yáng)離子交換量、可溶性蛋白含量和三磷酸腺苷 (ATP) 酶活性都顯著高于低效品種[8]，ND202還表現(xiàn)出根系發(fā)達(dá)、抗旱能力強(qiáng)的特點(diǎn)。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)棉花根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)受苗齡的顯著影響[29]。烤煙對(duì)鉀素的吸收、積累高峰出現(xiàn)在旺長(zhǎng)期，進(jìn)入成熟后，由于前期的大量吸收、鉀素隨水分流失、土壤對(duì)鉀素的礦化固定等影響，烤煙根際的速效鉀通常供應(yīng)不足，影響煙葉鉀的積累。生產(chǎn)上通常采用追施鉀肥的辦法來(lái)提高煙葉含鉀量。富鉀品種ND202根系活化土壤礦化鉀的能力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，活化能力較強(qiáng)，有利于根際鉀素的持續(xù)供應(yīng)和鉀含量的提高。研究發(fā)現(xiàn)ND202根系分泌物對(duì)土壤鉀具有較強(qiáng)的活化能力，可能與其根系分泌物中有機(jī)酸含量較高有關(guān)[7]。李廷軒等通過(guò)測(cè)定不同基因型籽粒莧根系分泌物中有機(jī)酸和氨基酸的含量，并進(jìn)一步模擬籽粒莧根系分泌物對(duì)土壤礦物鉀的活化能力，結(jié)果表明低鉀脅迫下，富鉀基因型籽粒莧根系分泌物中的氨基酸和有機(jī)酸含量，以及其分泌物對(duì)土壤鉀的活化作用都明顯高于一般基因型，其根際真菌和細(xì)菌的數(shù)量是一般基因型的3 倍以上[30–33]，研究也發(fā)現(xiàn)富鉀品種ND202也具有根際真菌和細(xì)菌數(shù)量較多的特點(diǎn)[7]。

目前煙草鉀吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的研究主要集中于鉀通道、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體和鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)調(diào)控基因三個(gè)方面[16]。鉀離子通道不僅能調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞氣孔開(kāi)閉[34]，影響根細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)能促進(jìn)植物對(duì)土壤中鉀的吸收[35]，調(diào)控根中鉀向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)[36]，協(xié)調(diào)鉀在植物源庫(kù)組織中的運(yùn)輸和分配[22]。代曉燕等[11]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)流型鉀離子通道基因表達(dá)量增加對(duì)提高烤煙鉀素累積是有利的。本研究發(fā)現(xiàn)成熟期富鉀品種ND202上部葉中的NKT1表達(dá)量顯著高于K326和NC89，根、上部和中部葉中NtKC1的相對(duì)表達(dá)量極顯著地高于NC89和K326，ND202的鉀離子通道基因NtTPK1在根、中部葉中極顯著地高于NC89和K326，有利于鉀離子的吸收。NTORK1與擬南芥SKOR/GORK鉀通道亞族同源，均屬于外向整流Shaker鉀通道，在葉片保衛(wèi)細(xì)胞和根表皮木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)，主要參與鉀在木質(zhì)部中的長(zhǎng)距離運(yùn)輸[22,36]。ND202下部葉中外流型鉀離子通道基因NTORK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著地低于NC89和K326，鉀素外排較少有利于鉀含量的提高。NtHAK1與擬南芥、水稻、大麥等植物的高親和鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因具有較高的同源性，在根、莖、葉及花中均有表達(dá)，且不受外界低鉀環(huán)境的誘導(dǎo)，在煙草栽培品種K326中表達(dá)后，轉(zhuǎn)化株的鉀含量顯著高于野生型，表明其可提高煙株富集鉀的能力[37]。ND202在根、上部葉和中部葉中NtHAK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著地高于K326和NC89，有利于鉀素運(yùn)轉(zhuǎn)和積累。李較等[26]研究發(fā)現(xiàn)NtKT12具有KUP/HAK/KT家族鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的共同特征，該基因在根中的表達(dá)量最高，而且受低鉀誘導(dǎo)。而本研究發(fā)現(xiàn)NtKT12在葉部的表達(dá)量要高于根部，這可能與本試驗(yàn)的取樣時(shí)期為成熟期，試驗(yàn)為正常供鉀有關(guān)。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，富鉀品種ND202具有成熟期根系較發(fā)達(dá)、根系吸收能力較強(qiáng)、鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因相對(duì)表達(dá)量較高、葉片中鉀積累量較大的特征。進(jìn)一步深入研究富鉀品種ND202根系分泌物、根際微生物與根際土壤有效鉀含量間的相互作用，以及對(duì)鉀素吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)的影響機(jī)制，對(duì)闡明煙草高效吸收鉀的機(jī)理，進(jìn)而篩選富鉀烤煙品種應(yīng)用于生產(chǎn)具有重要的意義。

參 考 文 獻(xiàn)：

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