暗光缺氧條件下微囊藻的存活及胞內(nèi)物質(zhì)釋放

陳桂欽 ,彭 琳 ,黃瑩瑩 ,李盼盼 ,張海春 ,陳雪初 ,3* (.華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海000；.上海市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,上海 00030；3.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心,上海 003)

藍(lán)藻水華爆發(fā)期間,沉降是影響水柱中藍(lán)藻生物量的重要因素[1-4],研究顯示沉降部分達(dá)到整個(gè)水柱藍(lán)藻生物量損失的30%[5].沉降至底泥-水界面的藍(lán)藻會(huì)受到暗光缺氧的脅迫.現(xiàn)有研究多集中在沉降藍(lán)藻的越冬機(jī)制,冬季藍(lán)藻通過形成休眠孢子[6],或者通過降低自身代謝水平來維持存活[7-10].然而,有研究顯示夏季從底泥中分離出的藍(lán)藻仍然存活并保持營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài),其酯酶活性甚至更高[11].表明夏季高溫條件下,沉降藍(lán)藻可能保持存活狀態(tài),但與冬季越冬行為有著完全不同的機(jī)制.與冬季休眠孢子保持低代謝水平不同的是,夏季沉降至底泥-水界面的藍(lán)藻依然保持正常甚至更高的代謝水平,其代謝產(chǎn)物將會(huì)影響底泥-水界面物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán).

夏季沉降藍(lán)藻在暗光缺氧脅迫下能夠保持存活,為證明這一假說,本研究模擬暗光缺氧條件,利用不同生長(zhǎng)期的微囊藻進(jìn)行存活實(shí)驗(yàn),并研究其有機(jī)碳、含氮物質(zhì)及藻毒素的釋放情況.

1 材料與方法

1.1 藻類培養(yǎng)

試驗(yàn)所用銅綠微囊藻(FACHB 942)購(gòu)自中科院武漢水生生物研究所,培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照強(qiáng)度為 4000lx,光暗比為 14h:10h,培養(yǎng)基為BG11.根據(jù)圖1所示生長(zhǎng)曲線分別收集培養(yǎng)時(shí)間為12、28以及55d的微囊藻.取一定體積的藻液,以 4000r/min離心 10min,摒棄上清液,用無菌純水洗滌后以4000r/min離心10min,重復(fù)3次,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置為暗光缺氧.將清洗過的微囊藻用純水進(jìn)行稀釋,12d組初始葉綠素 a (Chl a)濃度為 2.82mg/L,28d組初始 Chl a濃度為3.70mg/L,55d組初始Chl a濃度為4.20mg/L,每組設(shè)置 3個(gè)平行樣.利用 N2吹脫去氧(溶解氧濃度低于0.5mg/L),在N2保護(hù)下將藻液加入到血清瓶中,頂空,用密封瓶蓋密封瓶口,置于不透光黑色密封箱內(nèi),(25±1)℃條件下培養(yǎng).該實(shí)驗(yàn)為破壞性實(shí)驗(yàn),每3d隨機(jī)取3個(gè)血清瓶進(jìn)行測(cè)定,取樣測(cè)定Chl a濃度、細(xì)胞存活率(Viable cell ratio)、釋放物中溶解性總有機(jī)碳濃度(DOC)、溶解性總氮(DTN)濃度、氨氮濃度、藻毒素(MCs)濃度,之后該組血清瓶不再利用.

1.3 分析方法

葉綠素a濃度用AquaPen手持式藻類熒光測(cè)量?jī)x(Photon Systems Instruments, spol.s r.o.,Czech Republic)測(cè)量,存活率采用細(xì)胞分析儀測(cè)定(The Muse?Cell Analyzer, EMD Millipore Corporation, Germany),氨氮采用APHA標(biāo)準(zhǔn)法[12]測(cè)定,DOC、TN用總有機(jī)碳分析儀(Multi N/C 3100, Analytik Jena, Germany)測(cè)量,藻毒素采用微囊藻毒素檢測(cè)試劑盒(Express Technology Co.,Ltd)測(cè)定.

為了更好的表述數(shù)據(jù),采用以下專用名詞:(1)存活率,活體微囊藻細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的比例; (2)單位葉綠素的DOC釋放量(mg C/mg Chl a),即為單位葉綠素的微囊藻釋放出 DOC的量,計(jì)算方法為將細(xì)胞釋放 DOC濃度(mg/L)除以Chl a濃度(mg/L); (3)單位葉綠素的DTN釋放量(mg N/mg Chl a),即為單位葉綠素的微囊藻釋放出DTN的量,計(jì)算方法為將細(xì)胞釋放DTN濃度(mg/L)除以Chl a濃度(mg/L); (4)單位葉綠素的MCs釋放量(mg MCs/mg Chl a),即為單位葉綠素的微囊藻釋放出 MCs的量,計(jì)算方法為將細(xì)胞釋放MCs濃度(mg/L)除以Chl a濃度(mg/L).實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組參數(shù)采用方差分析法(ANOVA)分析比較.

2 結(jié)果與討論

2.1 暗光缺氧條件下微囊藻細(xì)胞存活率及生物量變化

圖2為暗光缺氧條件下微囊藻存活率變化.細(xì)胞存活率可以直接表征微囊藻的存活情況,由圖可知,在暗光缺氧條件下,短期內(nèi)細(xì)胞能夠維持較高存活率,之后迅速降低.其中28d組存活率降低最快,實(shí)驗(yàn)第 6d降至 6.51%;而此時(shí) 55d組存活率仍然較高,為 84.08%;12d組則處于中等水平,實(shí)驗(yàn)第6d存活率為32.99%.可知在暗光缺氧脅迫下,55d及 12d組存活時(shí)間可達(dá) 6d以上,28d組存活時(shí)間較短,低于 6d.總體而言,暗光缺氧脅迫下,藻細(xì)胞的存活時(shí)間 28d組<12d組<55d組.圖3為暗光缺氧條件下Chl a濃度在9d內(nèi)的變化,用Chl a濃度表征微囊藻生物量.結(jié)果顯示,28d組 Chl a濃度降低較快,6d后由3.69mg/L降至2.27mg/L,此時(shí)12d和55d組Chl a濃度與初始值相比沒有明顯降低,第 9d兩組的Chl a濃度開始降低.微囊藻Chl a的變化與其存活率變化相對(duì)應(yīng).

研究發(fā)現(xiàn)夏季水華期會(huì)有大量藍(lán)藻沉降至暗光缺氧的底泥-水界面[1-4].在黑暗和低溫條件下,微囊藻生長(zhǎng)受到明顯抑制,N充足但黑暗條件下25d后微囊藻衰亡[13].陳雪初等[14]研究發(fā)現(xiàn)在23℃時(shí),當(dāng)光照度小于 500lx,微囊藻的生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制.Furusato等[10]研究表明經(jīng)過 10d的黑暗限制之后,微囊藻生物量顯著下降,20d后降至初始細(xì)胞數(shù)量的1%.Shi等[15]研究發(fā)現(xiàn)在黑暗條件下,微囊藻比斜生柵藻適應(yīng)能力更強(qiáng),其細(xì)胞新陳代謝略微上升,且沒有明顯的細(xì)胞死亡.以上研究可知微囊藻在暗光環(huán)境下可以長(zhǎng)期存活達(dá)20d左右,且代謝率并沒有大幅下降.本文研究發(fā)現(xiàn),在模擬夏季底泥-水界面條件下,不添加氮源時(shí)微囊藻細(xì)胞可以存活達(dá)9d,表明微囊藻在暗光無氧的條件下仍然可以保持存活狀態(tài).

圖1 微囊藻生長(zhǎng)曲線Fig.1 The Growth curve of Microcystis

圖2 暗光缺氧條件下微囊藻存活率的變化Fig.2 Changes of the viable cell ratio under the dark/anoxic condition

圖3 暗光缺氧條件下微囊藻葉綠素濃度的變化Fig.3 Changes of Chlorophyll a concentration of Microcystis under the dark/anoxic condition

2.2 暗光缺氧條件下微囊藻DOC的釋放

由圖4可知,在實(shí)驗(yàn)第3d,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率均在80%以上,此時(shí)28d組的單位葉綠素DOC釋放量最高,達(dá)到1.86mg C/mg Chl a,12d及55d組分別為0.54、0.94mg C/mg Chl a.單位葉綠素DOC釋放量12d組<55d組<28d組.微囊藻存活率變化表明,12d和28d組微囊藻在實(shí)驗(yàn)第3d時(shí)存活率在 90%以上,此時(shí)其 DOC釋放曲線斜率較小,3d之后細(xì)胞存活率迅速下降,而DOC釋放曲線斜率也同時(shí)增大.55d組微囊藻在實(shí)驗(yàn)第 6d之后存活率降低,DOC釋放曲線的斜率同步增加.這表明,細(xì)胞存活率較高時(shí),雖然會(huì)有部分死亡細(xì)胞分解釋放DOC,但此時(shí)大部分有機(jī)碳等是存活微囊藻在代謝過程中釋放的,一旦細(xì)胞死亡釋放有機(jī)碳,其濃度會(huì)迅速增加.表明微囊藻細(xì)胞不僅在死亡分解時(shí)能釋放有機(jī)碳,在存活的情況下依然可以釋放有機(jī)碳.表明暗光缺氧條件下,存活的微囊藻能夠釋放有機(jī)碳.現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)太湖水體中膠體有積碳濃度為 1.79～2.05mg/L,占DOC的8.11%～22.13%[16].朱元榮[17]研究發(fā)現(xiàn)微囊藻水體中 TOC的主要物質(zhì)為氨基酸.孔繁翔[18]的研究結(jié)果表明巢湖水體中總?cè)芙庑蕴妓衔镎?總有機(jī)碳)TOC的比例最高為 26%,多糖和單糖所占比例分別為 21%和 6%.藻細(xì)胞能夠通過光合作用固定無機(jī)碳,現(xiàn)有研究已經(jīng)證明沉降藍(lán)藻死亡分解會(huì)釋放大量有機(jī)碳,從而促進(jìn)水體生物脫氮作用[19-21],但目前少有研究關(guān)注活藻與底泥-水界面氮脫除之間的關(guān)系.本研究發(fā)現(xiàn)活藻同樣也會(huì)釋放有機(jī)碳,在暗光缺氧條件下,存活微囊藻細(xì)胞單位葉綠素的DOC釋放量可達(dá)到1.86mg C/mg Chl a.

研究結(jié)果顯示,在暗光缺氧條件下,細(xì)胞的存活和有機(jī)物釋放與其生長(zhǎng)階段有關(guān).現(xiàn)有研究表明,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的藻細(xì)胞具有體積小,細(xì)胞壁薄,貯存物質(zhì)少等特征[22].在此階段,細(xì)胞代謝活性最強(qiáng),組成新細(xì)胞物質(zhì)最快,同時(shí)對(duì)理化因素影響敏感.進(jìn)入穩(wěn)定期后,細(xì)胞開始積累貯藏物質(zhì),這一時(shí)期細(xì)胞數(shù)量達(dá)到了最高水平,產(chǎn)物積累也達(dá)到了高峰[23].本文使用培養(yǎng)了12、28及55d的微囊藻作為研究對(duì)象,圖 1生長(zhǎng)曲線表明其分別處于對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定初期及穩(wěn)定后期.結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)第3d時(shí),在暗光缺氧脅迫下28d組微囊藻DOC釋放量最高.這可能與藻細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后,細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)開始積累有關(guān)[24-25].培養(yǎng) 12d微囊藻處于對(duì)數(shù)期,藻細(xì)胞代謝活性最強(qiáng),并且易受理化因素影響,細(xì)胞貯藏物質(zhì)較少[22],其存活時(shí)間較穩(wěn)定后期短,其胞外 DOC釋放也相應(yīng)的較少.培養(yǎng) 55d微囊藻處于穩(wěn)定后期,藻細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)積累較多,同時(shí)其細(xì)胞代謝較對(duì)數(shù)期低[26],在暗光缺氧脅迫下可以存活相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間,DOC的釋放量處于中間水平,低于穩(wěn)定初期,但高于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.

圖4 暗光缺氧條件下微囊藻DOC釋放Fig.4 Changes of DOC secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition

2.3 暗光缺氧條件下微囊藻氮素的釋放

圖5顯示暗光缺氧條件下微囊藻氮素的釋放量逐漸增加.實(shí)驗(yàn)第 3d,不同培養(yǎng)時(shí)間微囊藻的單位葉綠素 DTN 釋放量差別不大,均較低,而此時(shí)12d和55d組的單位葉綠素氨氮釋放量較高,尤其是12d組,其氨氮釋放量達(dá)到0.09mg N/mg Chl a;實(shí)驗(yàn)第6d, 單位葉綠素DTN釋放量增加,與DOC釋放情況不同的是,12d組的TN釋放量最高,而存活率較高的兩組(12d和55d)氨氮釋放量相對(duì)較高.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明存活微囊藻也能夠釋放氮素,但其釋放物的C/N較高,為3.00～7.83,表明暗光缺氧條件下微囊藻釋放的氮素利用自身釋放的 DOC即可通過生物反硝化過程去除,不會(huì)對(duì)水體產(chǎn)生額外的氮負(fù)荷.而相較于死藻,活藻有機(jī)會(huì)由于自身浮力調(diào)控機(jī)制或水體擾動(dòng)(大風(fēng)、湍流等)而重新上浮至真光層[27-29],通過光合作用重新積累有機(jī)碳,從而持續(xù)影響生物脫氮過程.

根據(jù)存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果及氨氮釋放情況推測(cè),夏季沉降藍(lán)藻可能存在與越冬不同的存活機(jī)制,硝酸鹽異化還原成銨(DNRA)可能是微囊藻細(xì)胞保持存活的途徑之一.DNRA是將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為可生物再利用的銨鹽[30].Kamp等[31]的研究表明硅藻可以利用細(xì)胞內(nèi)的NO3-進(jìn)行DNRA,從而可以在黑暗無氧的環(huán)境下長(zhǎng)期存活.本研究表明,培養(yǎng)液中氨氮濃度呈上升趨勢(shì),且12d和55d組細(xì)胞培養(yǎng)液中氨氮濃度較28d組高,相對(duì)應(yīng)的12d和55d組細(xì)胞的存活率也較高.由此推測(cè),暗光缺氧條件下微囊藻可能存在與海洋硅藻相類似的存活機(jī)制,即依靠DNRA過程來獲得能量從而維持生命活動(dòng),這一推測(cè)需要進(jìn)一步研究.

圖5 暗光缺氧條件下微囊藻氮素釋放Fig.5 Changes of nitrogen secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition(a):溶解性總氮;(b):氨氮

2.4 暗光缺氧條件下微囊藻毒素的釋放

圖6表明,實(shí)驗(yàn)第3d,各組單位葉綠素藻毒素釋放量較低,均低于 8.73μg MCs/mg Chl a.實(shí)驗(yàn)第 6d,55d組藻毒素釋放量最高,為 18.84μg MCs/mg Chl a;12d組藻毒素釋放量最低,為2.73μg MCs/mg Chl a.各組藻毒素釋放量隨著細(xì)胞存活率的降低而增加,其中 55d組藻毒素釋放量增加較大,另外兩組增加平緩.現(xiàn)有研究表明,夏季水體中藍(lán)藻沉降量能達(dá)到 15.00mg Chl a/m2[4-5],根據(jù)圖 6計(jì)算藻毒素釋放量低于 270μg MCs/m2,若水體深度為 2m,則釋放藻毒素濃度僅為 0.14μg/L,不會(huì)引起對(duì)水體中藻毒素濃度的急劇增加.

圖6 暗光缺氧條件下微囊藻毒素釋放Fig.6 Changes of MCs secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition

3 結(jié)論

3.1 暗光缺氧脅迫下,微囊藻細(xì)胞能夠存活一段時(shí)間,而不同生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞存活時(shí)間不同,其中培養(yǎng) 55d的微囊藻存活時(shí)間最長(zhǎng),超過 6d;Chl a的變化與其存活率相對(duì)應(yīng),但變化程度較小.

3.2 暗光缺氧條件下,微囊藻能夠持續(xù)釋放有機(jī)碳、含氮化合物以及藻毒素等物質(zhì),且物質(zhì)釋放量與其生長(zhǎng)期相關(guān).存活微囊藻細(xì)胞 DOC釋放量可達(dá)到 1.86mg C/mg Chl a,氨氮釋放量為0.09mg N/mg Chl a,釋放物的 C/N 較高,為3.00～7.83.

3.4 暗光缺氧條件下,微囊藻釋放出的藻毒素均低于8.73μg MCs/mg Chl a.

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